維生素E型微膠團飼料對刺參生長免疫及水質(zhì)的影響研究

■汪 將 徐永平,2 金禮吉,2 李曉宇 王熙濤 李建光 車 健

（1.大連理工大學生命科學與技術(shù)學院，遼寧大連 116024；2.教育部動物性食品安全保障中心，遼寧大連 116024）

刺參已經(jīng)成為中國發(fā)展最快的海水養(yǎng)殖品種，有限的天然餌料已不能滿足快速發(fā)展的刺參養(yǎng)殖業(yè)的需求，因此，投喂人工飼料成為必然趨勢[1]。由于刺參的攝食特點[2]及刺參人工飼料生產(chǎn)工藝的滯后，不僅造成刺參飼料的極大浪費，還嚴重影響水體環(huán)境，導(dǎo)致水中氨氮、亞硝酸鹽的含量升高，進而導(dǎo)致刺參生長速度下降，易發(fā)生病害[3-6]。本文通過微切變助互作技術(shù)生產(chǎn)一種微膠團飼料，考察微膠團顆粒飼料對刺參養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽水平的影響，同時考察在微膠團飼料中添加維生素E對刺參生長、免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器：高效液相色譜（安捷倫1100，美國）；高速低溫離心機（Eppendorf 5804 R,德國）。

藥品和試劑：維生素E標準品（Sigma，美國），溶菌酶、酸性磷酸酶試劑盒（南京建成），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

實驗所用刺參購于大連鶴盛豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場，初始體重(7.96±0.01)g。正式實驗前刺參暫養(yǎng)7 d，每天投喂海藻粉2次。

1.3 餌料制備

飼料組成見表1，飼料原料：魚粉、海泥、海藻粉、大豆粉、小麥淀粉、貝殼粉均購于鶴盛豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場（大連，中國）。維生素E醋酸酯（dl-α-tocopheryl酯）和維生素混合物（不含維生素E）購于HUYU生物技術(shù)公司（上海，中國），礦物質(zhì)混合物由SEM飼料公司提供（大連，中國）。

表1 餌料的基本組成（干重%）*

飼料生產(chǎn)工藝參照王黎[7]的方法略有修改：首先將原料在室溫下進行干燥（含水量≤15%），按比例稱取藻粉、魚粉、海泥、貝殼粉混勻進行粗粉碎（粒度250 μm）；向粗粉中加入淀粉、復(fù)合維生素和礦物質(zhì)混合均勻制成普通粉狀飼料；向普通粉狀飼料中加入不同水平的維生素E醋酸酯，使用α-纖維素將各組重量補齊；將部分粉狀飼料利用微切變助互作技術(shù)（專利號：ZL200510130852）在常溫下加工成超微粉飼料（粒度38 μm），將超微粉與純凈水按1∶1（W/W）比例混合成膠團狀，用壓片機壓成片狀，室溫條件下風干；最后用粉碎機破碎，篩分得到80～100目的微膠團飼料(粒度150～185 μm)。其中飼料中維生素E的添加量分別為0、50、100、200、500、1 000 mg/kg，其實際含量采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定，測定方法參照王安群等[8]，分析結(jié)果見表2。

表2 實驗飼料中維生素E含量的分析

1.4 實驗分組及養(yǎng)殖管理

將實驗刺參飼養(yǎng)于塑料水槽中（38 cm×54 cm×80 cm），實驗期間連續(xù)供氧，保證溶氧不低于5 mg/l；水溫維持在（15±1）℃，pH值為8.0±0.1，鹽度為30‰～32‰，每4 d換1次水。

將刺參隨機分配到21個水槽中，每個水槽15頭，共設(shè)7個實驗組每組，設(shè)3個重復(fù)，分別投喂普通粉狀飼料，E0～E1000組微膠團飼料。實驗時間60 d，實驗的第2、3、4 d測定各組水體中的氨氮、亞硝酸鹽含量；實驗結(jié)束后各組刺參計數(shù)、稱重，用于生長、免疫指標的測定。

1.5 水質(zhì)指標分析

水體中氨氮含量的測定采用納氏試劑法[9]；水體中亞硝酸鹽含量的測定參照袁廣旺等[10]的方法。

1.6 生長指標

特定生長率（Specific Growth Rate，SGR），計算公式如下：

式中：Wt是終體重；Wi為初體重；t為實驗時間（d）。

1.7 細胞免疫

從每個平行實驗組中隨機取15頭刺參置于冰上，用剪刀沿背部剪開，采集體腔液，并立即進行細胞免疫指標的測定，余下的體腔液使用低溫冷凍離心機在4℃，3 000 g離心10 min后取上清液，分裝于1.5 ml離心管中（每管0.5 ml），凍存于-70℃用于體液免疫指標的檢測。

體腔細胞計數(shù)參照Barracco等[11]方法并略作修改：取500 μl剛采集的體腔液于滅菌的1.5 ml離心管中，加入等體積的1.5 mg/ml的EDTA-Na2抗凝處理，混勻后取10 μl加入血球計數(shù)板計數(shù)（×400），每個細胞樣計數(shù)3次。

細胞超氧陰離子（O2-）測定參照孫永欣[12]方法，首先將分離得到的體腔細胞用細胞培養(yǎng)液（含有5%胎牛血清和0.5%抗生素的經(jīng)0.22 μm濾膜過濾滅菌海水）調(diào)至5×106個/ml，取0.5 ml稀釋后體細胞液與等體積的氮藍四唑（NBT）溶液（含有0.2%NBT的細胞培養(yǎng)液），11 μl佛波酯溶液（PMA,1 μM）和89 μl細胞培養(yǎng)液于1.5 ml無菌離心管中置室溫下孵育1 h，常溫離心（540 × g，10 min），棄上清，余下細胞加入1 ml 70%的乙醇重復(fù)清洗2次后離心棄上清，所得物質(zhì)用600 μl KOH（2 M）和700 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解，于625 nm下進行吸光度測定。

1.8 免疫酶活性

溶菌酶、酸性磷酸酶活性使用試劑盒測定：溶菌酶酶活定義為每分鐘吸光度減少0.001為一個酶活單位；酸性磷酸酶（ACP）酶活定義為37 °C時，100 ml血清30 min內(nèi)產(chǎn)生1 mg對硝基酚為1個酶活單位。

1.9 數(shù)據(jù)處理

各實驗組數(shù)據(jù)均以均值±標準誤（mean±SE）表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析，不同處理之間采用Ducan's多重比較，當P＜0.05認為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 水質(zhì)指標分析

粉狀飼料投喂后水體渾濁度高，大約3 h后沉入水底；而微膠團飼料水體澄清，大約5～10 min后沉入水底。由于刺參為地棲生物，行動緩慢，飼料更快的沉入水底能減少溶失并且便于刺參采食。投喂粉狀飼料和微膠團飼料水中氨氮的含量4 d內(nèi)的變化見圖1。從圖1中可以看出在第2、3 d時，投喂粉狀飼料的水體中氨氮的濃度迅速上升，第4 d氨氮的濃度則變化不大。而投喂微膠團飼料的水體在第2、3 d時氨氮的濃度變化不大，但第4 d上升較快。通過比較發(fā)現(xiàn)，投喂粉狀飼料的水體中氨氮的含量大約為投喂微膠團飼料的兩倍。

圖1 在4 d內(nèi)投喂不同飼料水體中氨氮含量的變化

對于刺參的室內(nèi)育苗和養(yǎng)殖來說，影響最大的水質(zhì)因子是氨氮和亞硝酸鹽[13]，長期處于過高的氨氮和亞硝酸鹽會影響刺參的生長代謝[4]，降低刺參的免疫水平[5-6]，因此本文對刺參養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽的含量進行了檢測。圖2顯示了投喂粉狀飼料和微膠團飼料水體中亞硝酸鹽的結(jié)果。圖2可見，投喂粉狀飼料的水體中亞硝酸鈉的濃度在第2 d迅速上升，之后上升的速度有所下降；而投喂微膠團飼料的水體中亞硝酸鈉的濃度在第2 d較低，但第3、4 d的濃度則出現(xiàn)了快速上升，但其總濃度仍低于投入粉狀飼料的水體。

圖2 在4 d內(nèi)投喂不同飼料水體中亞硝酸鹽含量的變化

2.2 生長指標

投喂不同飼料的刺參的特定生長率見表3。從表3可以看出投喂粉狀飼料與微膠團飼料相比前者的特定生長率稍低，這可能由兩方面因素造成：由于粉狀飼料溶失率高[7]，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的損失；通過微切助技術(shù)加工后，能使飼料成分更有利于飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。添加維生素E的微膠團飼料組，以E100組(100 mg/kg)的特定生長率最高，可能原因是由于維生素E作為一種抗氧化劑和抗應(yīng)激劑，能降低水產(chǎn)動物的應(yīng)激反應(yīng)，此研究結(jié)果與魚類[14-17]、蝦[18-19]、蟹類[20-21]結(jié)果類似。隨著飼料中維生素E含量的升高，刺參的特定生長率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這一趨勢也與已報道的刺身及其它水產(chǎn)動物的研究結(jié)果一致[22-28]。添加維生素E的微膠團飼料組的刺身存活率均為100%，說明飼料中添加維生素E能提高刺參的存活率。

表3 不同的飼料對刺參特定生長率及存活率的影響

2.3 細胞免疫

體腔液細胞組數(shù)和呼吸氧爆發(fā)的測定結(jié)果顯示（見表4），粉狀飼料組與微膠團飼料組間差異性顯著，說明溶失率低的微膠團飼料能提供給刺參更多的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高刺參細胞免疫水平。添加維生素E的微膠團各組飼料中，體腔細胞總數(shù)和呼吸氧爆發(fā)分別以E100和E50組較高，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于維生素E本身作為一種抗氧化劑，可能會與氧化性物質(zhì)反應(yīng)，降低呼吸氧爆發(fā)的水平，此結(jié)果與已報道的對蝦結(jié)果相類似[29]。

表4 投喂不同的飼料對刺參體腔細胞總數(shù)、呼吸氧爆發(fā)的影響(means±SE,n=3)

2.4 免疫酶

表5 投喂不同的飼料對刺參溶菌酶、酸性磷酸酶活性的影響(means±SE,n=3)

由于刺參是無脊椎動物動物，其免疫以天然免疫為主，天然免疫包括細胞免疫和體液免疫，而免疫酶則是體液免疫的主要手段之一[30]。因此，本文對刺身的免疫酶進行了研究，結(jié)果表明（見表5），與粉狀飼料相比，微膠團飼料能顯著提高刺參的溶菌酶活性。同時，飼料中添加維生素E可刺激刺參的非特異性免疫，提高溶菌酶的活性。其中E100、E200、E500組可以顯著提高溶菌酶活力（P＜0.05），以E200組的效果最為明顯，繼續(xù)增加飼料中維生素E添加量，溶菌酶活力反而有所降低。本實驗結(jié)果類似于已報道的維生素E對鯉魚血清溶菌酶的作用效果[22]。

酸性磷酸酶（ACP）是巨噬細胞溶酶體的標志酶，也是巨噬細胞內(nèi)具有代表性的水解酶之一。ACP能幫助刺參將表面帶有磷酸酯的異物通過水解作用破壞掉，從而達到預(yù)防感染的目的，并能加快對異物的識別、吞噬和清除速度[31]。因此，本文對刺參的ACP進行了考察，實驗結(jié)果表明（見表5）微膠團飼料組的ACP活性顯著高于粉狀飼料組，可能原因除了飼料中營養(yǎng)物質(zhì)溶失率較低外，還與微膠團飼料組水體中氨氮、亞硝酸鹽的水平較低有關(guān)。其中以E100組的效果最好，說明維生素E的添加是有一個最適水平的，這與張琴的研究結(jié)果類似[28]。

3 結(jié)論

本文利用微切變助互作技術(shù)生產(chǎn)維生素E型微膠團飼料，比較了普通粉狀飼料與維生素E型微膠團飼料對養(yǎng)殖環(huán)境下刺參水體中氨氮、亞硝酸鹽含量及刺參生長免疫的影響。實驗研究結(jié)果說明，和普通粉狀飼料相比，維生素E型微膠團飼料能明顯降低養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽的水平，提高刺參的特定生長率和免疫水平。另外，在飼料中加入維生素E能顯著提高刺參的特定生長率和存活率。飼料中以添加100 mg/kg的維生素E，對刺參生長和免疫的促進效果最好。