發(fā)酵菜粕中菜籽小肽分離純化及其體外抗氧化活性研究

■張 瑞 吳彩紅 凡海佳 李呂木 匡厚坤 汪雙喜 丁小玲

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.安徽太陽禽業(yè)有限公司，安徽寧國242300）

菜籽肽是菜籽蛋白經(jīng)蛋白酶作用，得到的蛋白質(zhì)水解物，由許多分子鏈長度不等的低分子小肽混合物組成。菜籽粕是油菜籽榨油后的副產(chǎn)物，是一種廉價而蛋白質(zhì)含量高的動物飼料。大量研究證實蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)并不僅僅是分解為氨基酸后才能被吸收，體內(nèi)還存在獨立的小肽直接吸收機制，且小肽的吸收效果更好[1]。小肽還具有某些特殊的生物活性，如增強免疫功能[2]、抗疲勞[3]、抑制血壓升高[4]及降低膽固醇[5]等作用，而這些作用均與其抗氧化活性密切相關(guān)。研究表明雙酶水解菜籽蛋白可得三種組分，各組分均有特定的抗氧化活性[6]。酶解所得到的菜籽肽具有較強的抗氧化活性和羥自由基清除能力,當(dāng)水解度達25%時，體外實驗羥基自由基清除率可高達80%[7]，且枯草桿菌中性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性大于枯草桿菌堿性蛋白酶酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性,并且其抗氧化活性隨酶水解產(chǎn)物添加量的增加而增強[8]。Yoshie等[9]通過測定菜籽蛋白水解產(chǎn)物對DPPH(1,1-dipheny l-2-picrylhydrazy；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；DPPH)自由基的清除能力來研究其抗氧化活性，結(jié)果表明菜籽蛋白經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，其抗氧化能力顯著增強。有研究表明，利用單菌固態(tài)發(fā)酵可以生產(chǎn)出不同分子量的菜籽肽，這些小肽具有清除自由基的能力，而且，肽的分子量越小，其清除自由基的能力越強[10]，即抗氧化活性越強。本實驗室利用枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌固態(tài)發(fā)酵菜麻粕后經(jīng)測定也富含小肽，但它們是否也具有抗氧化活性及其抗氧化活性強弱與否不得而知，為此，本研究通過分離純化發(fā)酵菜粕小肽，研究其抗氧化能力，為揭示發(fā)酵菜粕的生物功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵菜籽粕：由乳酸菌與枯草芽孢桿菌按照1∶1比例混合發(fā)酵，菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料科技研究所提供，接種比例6%。

試劑L-酪氨酸、藍色葡聚糖-2000、氧化型谷胱甘肽（還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制）和還原型谷胱甘肽由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；2,2-二苯基-1-苦味肼基(DPPH)由上海源葉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；膠Sephadex G-15購自北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司。

752紫外可見分光光度計和層析柱(2.6 cm×60 cm)分別為上海浦東物理光學(xué)儀器廠和上海錦華層析設(shè)備廠產(chǎn)品；HD-21-1核酸蛋白檢測儀、DHL-A電腦恒流泵和SBS-100自動液相色譜層析儀均為上海青浦瀘西儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵菜籽粕粗提液中的蛋白多肽的測定

采用福林酚法測定。按照料水比1∶6.0的比例（W:V）,先用無菌水浸泡發(fā)酵菜粕并攪拌5 min，然后過濾，濾液即為發(fā)酵菜粕蛋白多肽的粗提液。試管中加入粗提液樣品1.0 ml（空白為1.0 ml純水）,加A液（體積比A1∶A2∶A3=100∶1∶1，A1為20 g無水碳酸鈉+4 g氫氧化鈉溶于1 L水所得，A2為0.2 g五水硫酸銅溶于20 ml水所得，A3為0.4 g酒石酸溶于20 ml水所得）5ml，混勻后室溫放置10 min，再加B液（福林酚試劑）0.5 ml立即混勻，室溫放置30 min，在750 nm波長下以空白對照調(diào)零，測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測粗提液樣品的蛋白多肽濃度。

1.2.2 發(fā)酵菜籽粕中小肽的提取優(yōu)化

將樣品調(diào)成不同的料水比，通過Sephadex G-15分離純化，分析不同料水比的樣品經(jīng)Sephadex G-15層析后的洗脫曲線，得到最佳的提取效果。

1.2.3 發(fā)酵菜籽肽的分離純化

發(fā)酵菜籽肽粗提液過0.45 μm濾膜后進行分離純化，分離純化所用采用凝膠層析柱為Sephadex G-15。上樣量為1 ml，流速是0.5 ml/min，檢測波長為280 nm，洗脫雙蒸水的pH=7.0。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

凝膠層析組分小肽分子質(zhì)量測定用藍色葡聚糖-2 000測定外體積V0，用鉻酸鉀測總體積Vt。分別用L-酪氨酸(Mw=181.19)、還原型谷胱甘肽(Mw=307.32)、氧化型谷胱甘肽(Mw=612.6)上柱，層析柱(2.6 cm×60 cm)，上樣量為1 ml，洗脫流速是 0.5 ml/min，洗脫液為雙蒸水，檢測波長是280 nm，測得標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積Ve。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)(lgM)作為橫坐標(biāo)，洗脫體積（Ve）作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用菜籽肽粗提液代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法操作，得出洗脫體積，重復(fù)測定1～2次，取洗脫體積的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程算出樣品的分子質(zhì)量。

1.2.5 小肽含量及抗氧化測定

小肽的測定采用福林酚法[11]，重復(fù)測定2次。DPPH自由基清除作用的測定、·OH清除作用的測定和還原力測定參照彭惠惠等方法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 福林酚法測定多肽結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)福林酚試劑使用方法，分別測定濃度(mg/ml)為0.05、0.1、0.2、0.285 7、0.4、0.5的牛血清蛋白的OD值，得到結(jié)果分別是0.121、0.160、0.291、0.420、0.478、0.508。制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 菜籽多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 發(fā)酵菜籽粕蛋白多肽粗提液OD值測定

測得料水比為1∶6.0的發(fā)酵菜籽粕蛋白多肽粗提液的OD值為0.303，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白濃度為3.191 4 mg/ml，因此該發(fā)酵菜籽粕粗提液的蛋白多肽含量為19.15%。

2.2 發(fā)酵菜籽粕中小肽的提取優(yōu)化結(jié)果

研究不同梯度料水比對菜籽肽提取的影響，發(fā)現(xiàn)不同的料水比提取效果不同，在料水比為1∶5.5時取得最佳提取效果。

2.3 發(fā)酵菜籽粕中不同小肽的分離提取

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用L-酪氨酸(Mw=181.19)、還原型谷胱甘肽(Mw=307.32)、氧化型谷胱甘肽(Mw=612.6)的洗脫體積分別為 96、124、142 ml。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，擬合后所得回歸方程為：y=-87.117x+339.62，其相關(guān)系數(shù)為0.997 6，可見lgM與洗脫體積具有線性相關(guān)性。

圖2 Sephadex G-15測分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 Sephadex G-15檢測菜籽肽的相對分子質(zhì)量分布

經(jīng)Sephadex G-15凝膠色譜柱分離菜籽肽粗提液后，得到2個峰（見圖3），峰1和峰2的洗脫體積分別為87 ml和145 ml。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程，即可求得這兩個組分的分子質(zhì)量分別為794Da和171Da，即兩個組分為8肽、2肽。將收集的2個組分的洗脫液進行冷凍存放，待進一步分析。

圖3 菜籽肽Sephadex G-15柱層析洗脫圖譜

2.4 菜籽肽的抗氧化活性研究

2.4.1 菜籽肽對DPPH自由基清除作用(見圖4)

由圖4可知，分離得到的各菜籽8肽和菜籽2肽對DPPH自由基均具有清除能力，并且表現(xiàn)出很好的量效關(guān)系。2肽的清除率在各濃度下都高于8肽，可以得出對于濃度相同、分子量不同的小肽而言，清除DPPH自由基的能力2肽強于8肽。這與Chen等[13]的研究結(jié)果一致，即肽的分子量大小直接影響其抗氧化活性程度，其可能的原因是具有抗氧化活性小肽含有某些特殊的供氫基團能與自由基反應(yīng)，而這些基團只當(dāng)小肽分子量適當(dāng)時，才能得到最大的暴露充分并與自由基作用，進而發(fā)揮較強的抗氧化作用。

圖4 菜籽肽清除DPPH自由基能力的比較

2.4.2 菜籽肽對·OH自由基清除作用(見圖5)

圖5 菜籽肽清除·OH自由基能力的比較

由圖5可見，在試驗濃度（0.1～1 mg/ml）范圍內(nèi)菜籽肽對·OH均有清除作用，并且其抗氧化活性隨著菜籽肽濃度的增加而增強。由于菜籽肽中含有供氫體，能夠還原具有氧化性的自由基的質(zhì)子，從而使自由基連鎖反應(yīng)終止，實現(xiàn)抑制或清除自由基的目地。因此，隨著濃度的增加導(dǎo)致供氫體增多，使得提供質(zhì)子的能力增強，致使抗氧化性隨之提高。從圖5不難看出，羥基自由基的清除能力，菜籽2肽要強于菜籽8肽。

2.4.3 菜籽肽還原力測定(見圖6)

測定樣品的吸光度的大小可反映出還原力大小，還原力強則吸光度大。由圖6可見，在試驗濃度（0.5～5 mg/ml）范圍內(nèi)，菜籽肽總還原力與濃度的關(guān)系也是線性相關(guān)關(guān)系。眾所周知，抗氧化劑是通過還原作用給出電子來清除自由基的[14]，抗氧化性越強，其還原力也越強。本試驗中隨著肽濃度的增加，肽的抗氧化性也隨之增強，且2肽的還原力比8肽強，這一結(jié)果與清除DPPH、·OH自由基活性一致。用還原型谷胱甘肽作為對照，3 mg/ml 2肽、5 mg/ml 8肽和0.5 mg/ml谷胱甘肽的OD值相同，說明這些物質(zhì)的總還原力是相當(dāng)?shù)摹?/p>

圖6 菜籽肽總還原力的比較

3 結(jié)論

菜籽粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的2肽與8肽均具有抗氧化性，其抗氧化性與菜籽肽的濃度呈正相關(guān)，并且2肽的抗氧化能力比8肽強。