葎草組分測定、有效成分提取及不同提取物抗菌性的研究

■張 勇 黃 進(jìn) 蔡鳳英 劉來亭 胡新旭 計(jì) 成 馬秋剛

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.湖南省微生物研究所，湖南長沙410009；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193）

葎草（Humulus scandens(Lour)Merr）為?？拼舐閬喛迫劜輰僖荒昊蚨嗄晟荼局参?。藥學(xué)上具有清熱解毒、利尿通淋的功效。別名有拉拉秧、鋸子草、五爪龍等，葎草資源豐富，抗逆性強(qiáng)。葎草全草的化學(xué)成分復(fù)雜，含有木犀草素、葡萄糖甙、膽堿、天門冬酰胺，揮發(fā)油、鞣質(zhì)及樹脂等多種物質(zhì)。本文對葎草地上部分常規(guī)成分進(jìn)行了分析，利用GC-MS技術(shù)對葎草揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，以提取的溶質(zhì)量和生物堿以及類黃酮木犀草素為指標(biāo)，比較不同提取方法對葎草中有效成分提取的程度。進(jìn)一步對不同提取液提取出的活性成分進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，為篩選較好的提取劑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

葎草采自河南工業(yè)大學(xué)，分別采自5、7、9月份（分別代表苗期、生長期和盛果期）。樣品風(fēng)干后，粉碎過60目，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葎草常規(guī)成分分析

水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分分別按照GB6479-86、GB6432-86、GB6433-86、GB6438-86的方法進(jìn)行測定，氨基酸采用waters2695高效液相色譜儀測定。

1.2.2 揮發(fā)油成分的提取和測定

采用GC-MS(Finnigan Trace2000 GC-MS)測定揮發(fā)油成分。

定性分析：利用的數(shù)據(jù)庫為美國國家標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)研究所DATABA5E/NIST.98L；DATABASE/WILEY275。經(jīng)過系統(tǒng)質(zhì)譜庫自動檢索被分析組分的質(zhì)譜，分別參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜及質(zhì)譜的裂解規(guī)律、八峰索引、基峰質(zhì)荷比和相對豐度、EPA/NH以及有關(guān)文獻(xiàn)對照，以確定各個(gè)組分。

定量分析：扣除溶劑峰之后，化合物的定量使用Hewlett-Packard軟件，選擇設(shè)定適當(dāng)參數(shù)，按峰面積歸一化計(jì)算各較大峰的峰面積相對百分含量。

1.3 抗菌試驗(yàn)

1.3.1 葎草提取液的制備和活性成分檢測

取葎草樣品10 g，用濾紙包好，置于回流提取器內(nèi)，以95%乙醇為提取劑，以流水冷凝，在90℃水浴鍋內(nèi)回流提取3 h，將得到的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，放入真空干燥箱中烘干，所得固形物準(zhǔn)確稱量。后加入10 ml蒸餾水，超聲波分散溶解，得到95%乙醇提取液。同樣的方法分別以三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、蒸餾水作為提取劑，則分別得到三氯甲烷提取液、乙酸乙酯提取液、丙酮提取液、蒸餾水提取液。將五種葎草提取液滅菌后，分別用滅菌的生理鹽水將制成的各提取液稀釋成0.25～1 000 μl/ml 13個(gè)倍比稀釋系列濃度。

提取液中生物堿的定性檢測按照謝仲權(quán)（2004）碘化鉍鉀試劑法，定量測定按照雷氏鹽沉淀溶解比色法進(jìn)行；提取液中黃酮類測定參照郭亞?。?006）比色法，即以硝酸鋁顯色,以蘆丁為標(biāo)樣，測定A510制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 菌懸液的制備

參照熊皓平（2002）方法，在無菌工作臺中，將接種環(huán)在火焰上灼燒幾次，挑取少許菌苔于裝有9 ml滅菌生理鹽水的試管中，混勻，制成菌懸浮液。再吸1 ml菌懸浮液加入到有9 ml蒸餾水的試管中，以此類推得到菌懸浮液的濃度至菌體為109個(gè)/ml，4℃冰箱存放備用。

1.3.3 抑菌效力測定——濾紙片法

用打孔器將濾紙打成直徑11 mm的濾紙片，高壓滅菌后，分別浸泡于各提取液中。另取一些濾紙片浸泡于相應(yīng)提取溶劑內(nèi)，作為對照。將固體培養(yǎng)基高溫滅菌后倒入平皿，待冷卻凝固后，分別加入0.2 ml供試菌液，用無菌棒涂布均勻。用無菌鑷子夾取浸透各提取液的濾紙片，貼在含菌培養(yǎng)基的表面,每皿5片，另外用浸在氟哌酸的濾紙片作對照，用每種提取液設(shè)置一個(gè)校正對照，設(shè)3個(gè)重復(fù)。倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，比較各提取原液的抑菌效力。

1.3.4 MIC測定——平板稀釋法

參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》關(guān)于MIC的檢測方法，于直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中分別加入0.3 ml不同濃度的提取液，然后注入已經(jīng)融化的冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)液，立即旋轉(zhuǎn)混勻。待冷卻凝固后，每皿加入0.1 ml菌懸液涂勻培養(yǎng)，同時(shí)采用蒸餾水作為對照。置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃孵育24 h后置低倍鏡下觀察每一株菌在含不同藥物各種濃度瓊脂平板上陽性菌菌落數(shù)，取5個(gè)視野，以未見菌落生長的提取液濃度為MIC。

1.4 供試菌種

指示菌種為腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas punctata fintertinalis,58-20-79)，蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas sobria，CR79-1-1），熒光假單胞菌（Pseu?domonas fluoorescens,56-12-10），購自中國科學(xué)院水生生物研究所魚病室，三種菌是草魚“三病”的主要致病菌。普通培養(yǎng)基配方見表1。

表1 培養(yǎng)基配方

2 結(jié)果與分析

2.1 葎草常規(guī)成分的含量

葎草中粗蛋白、粗脂肪等常規(guī)成分見表2。氨基酸含量見表3。

2.2 揮發(fā)油組成成分

對葎草揮發(fā)性成分用GC/MS進(jìn)行分離得到了色譜離子流圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)?？傠x子流見圖1。對圖中經(jīng)EI圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)圖譜檢索定性，各組分相對質(zhì)量含量用峰面積歸一化法得到,結(jié)果見表4。從所鑒定的100多種成分中，鑒定出的成分占整個(gè)揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的78.44%。其中含量在3%以上的組分有：α-石 竹 烯 (16.120%)、葎 草 烯 (14.853%)、丙 二 醇(7.420%)、葎 草 酮 (3.561%)、2，5- 降 冰 片 二 烯(3.077%)。它們可作為該藥材的指紋性組分。

表2 葎草中常規(guī)成分和揮發(fā)油含量(%)

表3 葎草的主要氨基酸種類和含量以及化學(xué)評分(%)

2.3 不同提取劑提取液固形物

2.3.1 提取固形物的量

經(jīng)不同時(shí)間對提取液烘干稱量，得到最佳提取時(shí)間（不同的提取劑最佳的回流時(shí)間不同）時(shí)，不同的提取劑得到葎草提取液固形物量以95%乙醇提取液最高為8.4 mg，丙酮提取液為3.7 mg，蒸餾水提取液為2.2 mg，三氯甲烷提取液為1.1 mg，而乙酸乙酯得到的提取液中固形物最少，濃度僅為0.6 mg。從固形物含量來說，以乙醇提取劑效果較好。

2.3.2 提取物中總生物堿、總黃酮的含量（見表5）

從表5看出，乙酸乙酯提取物中生物堿的含量很低。而以乙醇和蒸餾水提取物中含量高。不同提取液提取的總黃酮量是不同的，以乙酸乙酯提取量較高。

2.4 抑菌效力測定結(jié)果（見表6）

從表6可見，葎草的5種提取液，抑菌效果雖然沒有氟哌酸藥液好，但對引起草魚的三大常見疾病的病原菌均有抑制作用。各提取液之間抑菌效果差別不顯著。

2.5 最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（見表7）

圖1 葎草揮發(fā)油總離子流

由表7可見，葎草95%乙醇提取液、乙酸乙酯提取液、丙酮提取液、三氯甲烷提取液、蒸餾水提取液對所試菌種均有不同程度的抑制作用，綜合效果來看，乙醇提取物抑菌效果最好。對蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌抑制效果次序是丙酮、95%乙醇、乙酸乙酯、蒸餾水和三氯甲烷等葎草提取液。對腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌抑制效果次序是95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷和蒸餾水提取液。對熒光假單胞菌抑制效果較好的是95%乙醇提取液，其他溶劑提取液效果相近。

3 討論

3.1 葎草常規(guī)組成成分結(jié)果

葎草成分干物質(zhì)中含粗蛋白較高，但粗纖維較高，又缺乏必需氨基酸，基礎(chǔ)飼料中含量高會影響飼料的消化、利用，也限制了直接作為添加劑加入到飼料中。李守陽（2003）對葎草進(jìn)行的分析顯示，粗蛋白在12.8%～19%之間。與本試驗(yàn)結(jié)論一致，說明不同產(chǎn)地的葎草在粗蛋白含量變化差異很小。

3.2 不同提取劑提取固形物

中草藥采用不同的提取方法得到成分差別很大（曲原君，2002）。本研究采用四種不同的提取方法，按照提取的有效成分抑菌活性和提取物中固形物的含量來進(jìn)行比較以選出相對經(jīng)濟(jì)、有效的提取方法以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。檢索近十年有關(guān)植物提取物的文獻(xiàn)中，其中使用乙醇和水作溶劑的比較多。關(guān)于采用乙醇的濃度，在本研究預(yù)試驗(yàn)時(shí)，已經(jīng)對乙醇的提取濃度和提取時(shí)間進(jìn)行了篩選，選用95%濃度乙醇來提取效果最好。提取物中生物堿的含量達(dá)3%以上，總的黃酮類也達(dá)2%以上。雖然提取的總生物堿和總黃酮的含量有點(diǎn)低，可能與沒有對提取物純化有關(guān)。在不明白何種組分起作用的情況下，只提取不純化可以盡量維持原藥物成分不變。

表4 葎草全草中揮發(fā)成分

表5 不同提取物中總生物堿和總黃酮的含量

表6 不同提取物的抑菌作用（抑菌圈直徑,mm）

表7 葎草提取液對三種菌的最小抑菌濃度(μl/ml)

3.3 葎草提取物中總生物堿、總黃酮的含量

生物堿在植物體內(nèi)多以鹽的形式存在，而弱堿性或中性的生物堿則以不穩(wěn)定的堿或游離的形式存在。生物堿鹽類一般不溶于親脂性有機(jī)溶劑而溶于水或醇（謝仲權(quán)，2004）。因此本研究用乙醇和水為提取劑所得生物堿含量高。

黃酮類在自然界中分布廣泛，屬植物次級代謝產(chǎn)物，因多呈黃色而稱生物類黃酮，大多數(shù)綠色植物中都含有黃酮類化合物，對于葎草中黃酮的含量報(bào)道很少。目前總黃酮的提取方法主要有水提取、堿提酸沉、乙醇提取、微波輔助提取、超臨界萃取等方法（Zhang等,2003）。本研究中提取率最高的是用乙酸乙酯作提取劑，但從固形物和活性成分的總量方面考慮，選乙醇作溶劑提取效果比較好。

3.4 抑菌效力測定結(jié)果

高漢橋等（1996）認(rèn)為在生產(chǎn)中因地制宜地選擇具有抑菌作用的中草藥防治由嗜水氣單胞菌引起的魚病，可能具有實(shí)際意義。很多中草藥的乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)被證明對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌有抑制作用（宋學(xué)宏，2001；李軍紅等，2006）。周群蘭等（2007）用大黃提取物觀察對嗜水氣單胞菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)大黃提取物對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不同病原菌有不同的抑制作用。氣單胞菌(Aeromonas hyd rophi?la)隸為人、畜及水生動物共患的條件致病菌，廣泛存在于水環(huán)境中，是多種水產(chǎn)動物的主要致病菌。通過紙片藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葎草醇提取物對氣單胞菌的抑菌圈直徑達(dá)9 mm左右，雖然沒有周群蘭（2007）用大黃提取物抑菌圈直徑可達(dá)29 mm效果好，但與葉元土等（1994）發(fā)現(xiàn)大黃煎劑對鯉爛鰓病原菌的抑菌圈直徑可達(dá)10 mm以上效果相當(dāng)。

4 小結(jié)

測定了葎草中粗蛋白質(zhì)含量為15.5%、粗脂肪4.2%、粗灰分8.3%、粗纖維19.1%。通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葎草的各提取液對引起魚類疾病的三種病原菌均有一定的抑制效果，結(jié)合比較不同溶劑提取方法所含固形物的量，以95%乙醇溶液提取含固形物最高，固形物中總生物堿的量為3.58%，總黃酮量為2.12%。