?；撬釋DCC-MSB1細(xì)胞端粒酶表達(dá)水平及其活性的影響

■于洋洋 陳 濤 邱淑敏 林淑梅 胡建民 漢麗梅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

?；撬?Taurine)又名2-氨基乙磺酸，是一種由含硫氨基酸轉(zhuǎn)化而來的條件必需氨基酸。在生物體內(nèi)參與一系列的生理學(xué)過程，在抗自由基、抗氧化和抑制腫瘤方面發(fā)揮了很大的作用。腫瘤發(fā)生是一個多基因參與、多水平作用的過程，這一過程還需要一定的時空順序，它的發(fā)生與原癌基因和抑癌基因的失控有關(guān)，這些分子事件共同控制著正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程。端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，由端粒酶催化亞基（chTERT）和端粒酶RNA（TR）兩部分組成，它能將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端，對腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖進(jìn)而成為永生化細(xì)胞起重要作用[1],是腫瘤標(biāo)志物之一。本研究旨在探討不同濃度的牛磺酸對雞MDCC-MSB1細(xì)胞系chTERT的mRNA表達(dá)水平及其端粒酶活性的影響，為?；撬峥鼓[瘤作用機(jī)制研究及臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

MDCC-MSB1細(xì)胞系（本研究室保存）；MEM培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基（GEBICO），胎牛血清（四季青公司），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2000 Marker（TaKaRa公司），Go Taq Green Master Mix（上海生工）；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒（南京建成），Chaps裂解液，牛磺酸（北京嘉康源化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ?；撬徇m宜應(yīng)用濃度測定

應(yīng)用含?；撬岱謩e為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代雞胚成纖維細(xì)胞24 h后，采用MTT法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況，細(xì)胞增值率=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)%，經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析確定牛磺酸應(yīng)用的適宜濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與試驗分組

RPMI1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）培養(yǎng)MDCCMSB1腫瘤細(xì)胞，于對數(shù)生長期進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并分組，應(yīng)用含?；撬岱謩e為2%、1%、0.5%、0%的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每個濃度組4個重復(fù)，培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞。

1.2.3 chTERT基因mRNA表達(dá)水平檢測

參照NCBI中已發(fā)表的雞chTERT基因序列，在保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計（chTERT up：5’-GTCAGAGC?GAAGTCATCACAAGAAT-3’，chTERT down:5’-TG?GCAAAACTCTGAAGTGACAAC-3’，產(chǎn)物大小為119bp），以β-actin為內(nèi)參基因（β-actin up：5’-ACGTCG?CACTGGATTTCGAG-3’，β-actin down：5’-TGT?CAGCAATGCCAGGGTAC-3’，產(chǎn)物大小為282 bp），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

采用TaKaRa公司RNA提取試劑盒對MDCCMSB1總RNA進(jìn)行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA的完整性，并測定濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，（條件為：42 ℃，2 min，37 ℃，15 min、85 ℃，5 s）。PCR擴(kuò)增體系：6 μl RNase Free dH2O，1 μl cDNA1，引物各0.5 μl，Go Taq Green Master Mix 10 μl，共 20 μl（β-actin 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，延伸72℃ 10 min；chTERT：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)，延伸72 ℃ 5 min）。

取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.4 TRAP銀染法測端粒酶活性

采用的改進(jìn)TRAP法進(jìn)行端粒酶活性測定[2]，相對端粒酶活力＝總條帶強(qiáng)度/0.02 amol R5擴(kuò)增產(chǎn)物條帶強(qiáng)度×20。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釕?yīng)用適宜濃度檢測結(jié)果

分析結(jié)果表明：與對照組（0%）相比，2%、3%，4%?；撬峤M的細(xì)胞增殖率呈上升趨勢，其中3%牛磺酸組細(xì)胞增殖率上升顯著（P＜0.05），4%?；撬峤M增殖率上升極顯著（P＜0.01），5%，6%，7%?；撬峤M的細(xì)胞增殖率降低，其中7%?；撬峤M增殖率降低極顯著（P＜0.01）。?；撬釕?yīng)用適宜濃度分析結(jié)果表明，?；撬崾褂脤?xì)胞的安全濃度范圍小于2%。根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)3%、4%的?；撬釙﹄u成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)生長的效果，5%以上的牛磺酸會對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用（見表1）。因此2%以下?；撬釢舛葹檫m宜應(yīng)用濃度。

2.2 chTERT mRNA表達(dá)水平分析結(jié)果

表1 ?；撬釕?yīng)用適宜濃度分析結(jié)果

分析結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度添加?；撬峤M培養(yǎng)的MD細(xì)胞chTERT mRNA表達(dá)水平均降低，其中1%、2%?；撬峤M的chTERT mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（見表2、圖1）。

2.3 端粒酶活性分析結(jié)果

分析結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度添加?；撬峤M的細(xì)胞端粒酶活性均降低，其中1%、2%?；撬峤M的細(xì)胞端粒酶活性極顯著降低（P＜0.01）。?；撬峥赡芫哂邢抡{(diào)MD細(xì)胞端粒酶活性的功能，且隨著?；撬釢舛鹊脑黾?，端粒酶活性隨之降低。

表2 ?；撬釋D腫瘤細(xì)胞的chTERT表達(dá)水平測定與分析結(jié)果（10-2）

圖1 chTERT基因半定量RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 各組MD腫瘤細(xì)胞端粒酶活性電泳結(jié)果

表3 相對端粒酶活性測定與分析結(jié)果

3 討論

近年來，國內(nèi)外有關(guān)端粒酶與腫瘤的研究表明，在腫瘤發(fā)生的多個階段，端粒酶都參與了腫瘤細(xì)胞凋亡和基因組穩(wěn)定的調(diào)控過程。端粒酶在腫瘤組織中檢出率很高，其活性的表達(dá)與細(xì)胞衰老和某些疾病，尤其是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，因此，端粒酶已經(jīng)被公認(rèn)為目前已知的最為廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一[3]。端粒酶催化亞基TERT是決定端粒酶活性的主要因素，其表達(dá)水平的高低決定端粒酶活性的高低[4]。TERT過表達(dá)可引起細(xì)胞的永生化，腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性越高，細(xì)胞的惡性程度也越高[5]。

此外，許多研究表明?；撬崮芤种颇[瘤細(xì)胞的增殖，其抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白合成、增強(qiáng)機(jī)體免疫、提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)、抑制腫瘤細(xì)胞增值等途徑實現(xiàn)的[6-8]。本研究應(yīng)用添加不同濃度?；撬岬呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)MDCCMSB1細(xì)胞，并對其端粒酶活性、chTERT基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，來探討?；撬嵩谝种颇[瘤細(xì)胞凋亡方面的作用，研究結(jié)果預(yù)示牛磺酸可能通過抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的表達(dá)水平，在一定程度上起到抑瘤作用。