ATP6V0A2基因變異影響彈性纖維合成的機制研究進展

李無言, 王佳琦, 郭 鑫

綜 述

ATP6V0A2基因變異影響彈性纖維合成的機制研究進展

李無言, 王佳琦, 郭 鑫

ATP6V0A2基因； 彈性纖維合成； 皮膚松弛癥

皮膚松弛癥(congenital cutis laxa, CL)是一類因體內(nèi)彈性纖維合成或分泌異常而導致身體各部位皮膚呈早衰樣病變的疾病。皮膚松垂、彈性缺失和以面部為主的身體各部位皮膚出現(xiàn)與年齡不符的衰老征象是該病最主要的臨床表現(xiàn)。CL多為遺傳性，國內(nèi)外也有重癥感染或炎性疾病后出現(xiàn)獲得性皮膚松弛的病例報道[1-2]。 目前，遺傳性CL依照基因突變位點及遺傳方式不同可分為5型：常染色體顯性遺傳性，突變定位在編碼彈性蛋白的ELN基因；伴性遺傳性，突變定位在Xq13.3上的ATP7A基因；常染色體隱性遺傳Ⅰ型，該型由Fibulin5或Fibulin4突變引起；常染色體隱性遺傳ⅡA型，主要由ATP6V0A2突變導致；常染色體隱性遺傳IIB型，突變主要定位在PYCR1基因上[3-4]。 在各型遺傳性CL中，常染色體隱性遺傳性(autosomal recessive cutis laxa, ARCL)是發(fā)病率最高且臨床表現(xiàn)最復雜的類型[5]。 各型基因突變均因在不同程度上影響到彈性蛋白分泌和彈性纖維構(gòu)建，而出現(xiàn)皮膚松弛、疝氣、體內(nèi)管腔結(jié)構(gòu)憩室或臟器下垂等結(jié)締組織乏彈性的臨床表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，ARCLIIA型以基因ATP6V0A2突變?yōu)橹饕∫?，以全身廣泛性皮膚松弛、囟門閉合延遲、生長發(fā)育遲緩為突出特征[2]。筆者總結(jié)并學習了近期對ARCLIIA型患者的分子生物學研究及其突變影響彈性纖維發(fā)育的機制，并對ATP6V0A2基因編碼蛋白作用位點V-ATPase的生理功能及彈性纖維合成途徑進行回顧。

1 基因的定位與功能

ATP6V0A2是定位于12q24.31的正鏈轉(zhuǎn)錄外顯子基因，包含49 438個堿基對，其起始堿基距端粒約124 196 865 bp，編碼組成囊泡型ATP驅(qū)動型質(zhì)子泵(vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase)的a2亞基[6]。 V-ATPase，顧名思義，通過水解ATP產(chǎn)生能量耦聯(lián)激活氫離子傳送通道，把氫離子從細胞漿傳送至細胞里的各種囊泡內(nèi)，這些囊泡既包括囊性細胞器官如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等，也包括細胞產(chǎn)生的分泌囊泡及胞內(nèi)物質(zhì)交換囊泡。 V-ATPase作為氫離子轉(zhuǎn)運體在胞漿及胞內(nèi)器官的酸堿平衡維持及胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運上起到了巨大的作用。同時其分布具有廣泛性和多功能性，V-ATPase的功能與多種生理行為如胞內(nèi)外源性毒素排出、腎小管尿液酸化、破骨與骨質(zhì)吸收、成年人脊椎再生能力、精子成熟與儲存有密切關聯(lián)[7-8]。 Hucthagowder等[9]指出，V-ATPase的變異同樣是造成常染色體隱性遺傳性皮膚松弛癥Ⅱ型A, Debre′ type (autosomal recessive cutis laxa type 2A, ARCL2A )患者產(chǎn)生皮膚松弛癥狀的重要原因。

V-ATPase由兩大結(jié)構(gòu)域V0與V1構(gòu)成，被一個由8、9個穿膜螺旋分子和一胞漿內(nèi)N端脂蛋白組成的中心柱連接[10]。 V1位于膜外，經(jīng)化學定量法測得由8個不同的亞基及3個ATP結(jié)合位點構(gòu)成，是酶結(jié)合并水解ATP產(chǎn)生能量的結(jié)構(gòu)[8]。V0鑲嵌于膜上，是由6個亞基構(gòu)成的氫離子通道復合體。各亞基在生物體內(nèi)呈動態(tài)的分解與聚合平衡，該平衡既受RAS/cAMP/PKA通道影響，也受胞外環(huán)境如pH、滲透壓、糖濃度影響[11]。聚合的過程也是儲存ATP與轉(zhuǎn)運質(zhì)子的過程。ATP在V1中水解產(chǎn)生的能量催動中心柱螺旋結(jié)構(gòu)帶動中心柱旋轉(zhuǎn)打開V0的氫離子通道口，實現(xiàn)胞漿內(nèi)和囊泡內(nèi)的質(zhì)子交換。鏈接兩大結(jié)構(gòu)域的中心柱也被稱為a亞基，它具有4種同分異構(gòu)體的表達。除了a4，其余3型a亞基在生物體內(nèi)廣泛表達并且相互覆蓋[12]。 Fischer等在最近的研究中證實，V-ATPase的a2亞基定位主要集中在高爾基體上，并且在ATP6V0A2變異患者的表皮成纖維細胞中缺失[13]。

2 彈性蛋白的翻譯與修飾、沉積過程

彈性纖維由兩大蛋白質(zhì)成分構(gòu)成，即彈性蛋白和微絲支架。彈性蛋白是由其可溶性前體彈性蛋白原(tropoelastin, TE)經(jīng)集合和橋連后形成。TE是ELN基因翻譯的主要產(chǎn)物，大小為60～72 kDa[14]。 TE的C-端是影響其聚集成彈性蛋白的重要一級結(jié)構(gòu)，因為該端存在由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵，若該鍵被破壞甚至C-端被去除，則TE聚集成彈性蛋白的過程將直接受到影響。TE被轉(zhuǎn)運至細胞外后相互間結(jié)合成彈性蛋白，這個自發(fā)的結(jié)合過程被稱為凝聚。凝聚后的彈性蛋白多為堅實的球狀小體，直徑在幾微米到十幾微米之間，并被彈性蛋白結(jié)合蛋白(EBP)錨定在細胞膜上構(gòu)建集合位點。在集合位點多個彈性蛋白繼續(xù)通過離子鍵相互集合至達到一定的分子量后EBP斷開，彈性蛋白被釋放入胞外基質(zhì)中，在賴氨酰氧化酶的作用下，進一步通過相互交聯(lián)鞏固連接強度，然后附著于微絲形成的骨架上完成彈性纖維的合成過程[15]。

體內(nèi)絕大多數(shù)的彈性纖維在胚胎發(fā)育時期合成，并且這些彈性纖維被認為能為結(jié)締組織提供終生的彈性，所以彈性纖維的合成在成人時期非常少[16]。 成人后新合成的彈性纖維無法形成正常的3D結(jié)構(gòu)，因此非常脆弱[17]。

3 突變導致皮膚松弛的分子生物學研究

3.1 ATP6V0A2對TE轉(zhuǎn)運機制產(chǎn)生障礙

3.1.1 高爾基體內(nèi)酸堿度改變 Hucthagowder等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，ARCLIIA患者的皮膚成纖維細胞存在TE修飾和分泌障礙。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，患者的成纖維細胞中存在大量高爾基體碎片以及異常運輸囊泡的聚集，并且洛霉素A誘導實驗(brefeldin a treatment)也表明存在高爾基體來源的運輸小體降解延遲現(xiàn)象[9, 18]。正常情況下，TE合成后會通過基本分泌途徑被快速釋放到胞外。分泌過程的正常執(zhí)行依賴于囊泡內(nèi)酸性環(huán)境，故該過程可被洛霉素A或者氯化銨抑制。洛霉素A會阻止V-ATPase功能而影響質(zhì)子向囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運，而氯化銨直接中和囊泡內(nèi)酸。 TE蛋白具有雙相性。當TE濃度、離子強度、溫度和周圍pH升高時，TE加速轉(zhuǎn)化為凝聚相，進而產(chǎn)生高密度的彈性蛋白，形成正常的彈性纖維沉積于真皮組織。凝聚相在中性環(huán)境中出現(xiàn)在37 ℃，而在酸性環(huán)境中出現(xiàn)在40 ℃。 該機制保證了正常體溫下TE在囊泡中呈溶解相因而便于運輸，但在胞外環(huán)境中呈凝聚相而更易形成彈性纖維。所以，ATP6V0A2的突變直接導致囊泡內(nèi)pH的升高使TE提前凝聚，影響其正常轉(zhuǎn)運并沉積在高爾基體等胞內(nèi)囊泡內(nèi)[19]。

3.1.2 糖基化障礙 在各種翻譯后修飾形式中，糖基化是最常見的蛋白質(zhì)共價修飾。糖基化是通過酶促反應使單糖或多聚糖或者脂類經(jīng)共價鍵連接于初生蛋白的過程。這一過程涉及諸多細胞功能如免疫反應、蛋白質(zhì)折疊、修剪及運輸?shù)取?在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中初生蛋白被合成、折疊，被轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多聚糖修飾后在高爾基體內(nèi)進一步成熟。這個過程不僅需要多聚糖轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶及基板的精確定位，更需要被高效準確調(diào)節(jié)的雙向胞內(nèi)細胞間囊泡運輸[20]。 糖基化種類繁多，最常見的包括3大類：-N-糖基化的糖類或其他附件連接到天冬酰胺殘基上； O-糖基化的附件連接于絲氨酸或蘇氨酸的羥基上；C-糖基化通過C-C鍵連接于色氨酸的第二碳原子上[21]。迄今為止發(fā)現(xiàn)的由ATP6V0A2功能缺陷導致的是N-糖基化障礙和O-糖基化障礙。其具體機制仍不明確，目前提出兩種假設，其一是V-ATPase活性降低導致高爾基體內(nèi)酸堿平衡影響了多聚糖轉(zhuǎn)移酶的活性；其二是由Mayer等提出的V-ATPase的V0區(qū)域與膜間融合有關，其功能喪失影響了囊泡間的融合[22]。 而且，糖基化障礙的作用基因不止ATP6V0A2一種，有報道COG7-CDG、 PMM2-CDG、DPAGT1-CDG以及ALG8-CDG 的突變，均可導致CDG癥狀出現(xiàn)[23]。

3.2 ATP6V0A2患者成纖維細胞轉(zhuǎn)化生長因子表達增高

2001年，T Saito等報道正常人成纖維細胞培養(yǎng)上清液中的活性轉(zhuǎn)化生長因子濃度在檢測閾值以下。 多名學者都在影響胞外基質(zhì)形成的綜合征----其中包括常染色體顯性遺傳皮膚松弛癥(autosomal dominant cutis laxa, ADCL)和ARCL-中發(fā)現(xiàn)TGF-β表達上調(diào)，其患者成纖維細胞培養(yǎng)上清液中可檢測到轉(zhuǎn)化生長因子[24-26]。 Callewaert提出成纖維細胞表達的變異型彈性蛋白極大地增強了TGF-β信號；也有學者在ARCLⅡ患者的成纖維細胞培養(yǎng)上清液中測得TGF-β1及其未經(jīng)校準的下游信號。關于TGF-β表達增強的原因目前主要推測有兩種，即胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM)成分破壞和LTBPs的受損。LTBPs是大延遲復合體(large latency complex)的一部分，與TGF-β在ECM上的定位有關[27-28]。

TGF-β1可促進成纖維細胞合成彈性纖維。Katchman等[29]指出，TGF-β1可增加CAT等彈性蛋白翻譯激活因子促進TE的轉(zhuǎn)錄 。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過激動Smad、PC、PLC等信號通路來減少或改善皮膚松弛癥患者的成纖維細胞中TE mRNA的不穩(wěn)定性。 Dial等發(fā)現(xiàn)，TGF-β1會降低胞外基質(zhì)中彈性纖維蛋白酶MMP-2、MMP-9水平。TGF-β1可通過調(diào)節(jié)TE 前體活性、mRNA穩(wěn)定性，彈性纖維降解之間的平衡來促進彈性纖維合成[31]。因此筆者認為，TGF-β1在ARCLII患者的成纖維細胞中得到高表達是機體對不正常胞外組織進行的負反饋調(diào)節(jié)。但是有學者認為，與定位在胞內(nèi)溶酶體膜上的ATP6V0A2功能缺陷使溶酶體與其他囊泡器官循環(huán)障礙有關，如Chen等[32]發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞溶酶體的循環(huán)障礙增強了Smad2磷酸化，也可能是TGF-β水平增高的原因之一。 然而也有學者發(fā)現(xiàn)，在胚胎肺成纖維細胞和胚胎動脈細胞中，TGF-β1增加CAT活性。而在皮膚成纖維細胞中作用不明顯。這些發(fā)現(xiàn)暗示，TGF-β1在激活彈性蛋白轉(zhuǎn)錄的作用上具有組織特異性(VM K?h?ri, 1992年；V Marigo, 1993年)。 Janson等[33]的最新實驗結(jié)果也間接證明了這一點，人皮膚組織中培養(yǎng)出的乳突狀成纖維細胞無法在TGF-β刺激下分化出網(wǎng)狀成纖維細胞，而培養(yǎng)基培養(yǎng)出的乳突狀成纖維細胞則可以。所以，TGF-β1升高對于皮膚中彈性纖維合成的影響仍需進一步研究。

4 前景與展望

遺傳性CL的基因突變及其引起的連鎖性分子生物學變化的研究，對于揭示正常皮膚在彈性纖維合成及構(gòu)建方面具有重要作用。雖然ATP6V0A2突變使V-ATPase的a2亞基異變，影響成纖維細胞的分泌及合成彈性纖維功能已經(jīng)得到證實，但是，由其他因素導致的V-ATPase結(jié)構(gòu)變異與廣泛性皮膚松垂表型的關聯(lián)性，仍然缺乏證據(jù)。所以，目前的實驗結(jié)果仍然無法恰當?shù)亟忉屧撏蛔兣c臨床表型的因果關系。另外，迄今為止報道的CL病例發(fā)病階段不同，病情輕重各異，各型之間外顯癥狀相互重疊，僅ARCLIIA患者中被報道的臨床癥狀嚴重程度就存在極大差別[9]。 因此，為什么該基因突變所引起的外顯病癥具有如此顯著的組織特異性，仍需大量工作進行證實。而在瘢痕學方面，目前已知遺傳性CL的瘢痕愈合過程，與正常人相同，對于能夠耐受手術(shù)的患者，整形外科治療對其心理維護及社會融合有很大意義。然而正確的診斷對于遺傳性或獲得性CL患者是否可以選擇整形外科治療至關重要，因為在某些具有皮膚松弛或超彈性的綜合征，如Marfan綜合征、彈性纖維假黃瘤、ED綜合征等皮膚切口瘢痕有增生傾向，手術(shù)效果往往適得其反[2,34]。 皮膚同樣在彈性纖維結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常的特征中，導致和不導致瘢痕增生的條件的研究，可能會對揭示瘢痕增生機制給出提示因素。

[1] Riveros CJ, Gavilán MF, Fran?a LF, et al. Acquired localized cutis laxa confined to the face: case report and review of the literature[J]. Int J Dermatol, 2004,43(12):931-935.

[2] 曹思佳, 田亞華, 于 江. 獲得性皮膚松弛癥一例[J]. 中華醫(yī)學美學美容雜志, 2012,18(5):393-394

[3] 江 匯, 汪 華. 皮膚松弛癥及其分型的研究進展[J]. 中華整形外科雜志, 2011,27(6):472-476.

[4] 鄒 翀. 遺傳性皮膚松弛癥的研究進展[J]. 中國美容醫(yī)學, 2012,21(5):875-877

[5] Morava E, Guillard M, Lefeber DJ, et al. Autosomal recessive cutis laxa syndrome revisited[J]. Eur J Hum Genet, 2009，17(9):1099-1110.

[6] Smith AN, Lovering RC, Futai M, et al. Revised nomenclature for mammalian vacuolar-type H+-ATPase subunit genes[J]. Mol Cell, 2003,12(4):801-883.

[7] Kornak U, Reynders E, Dimopoulou A, et al. Impaired glycosylation and cutis laxa caused by mutations in the vesicular H+-ATPase subunit ATP6V0A2[J]. Nat Genet, 2008,40(1):32-34.

[8] Monteiro J, Aires R, Becker JD, et al. V-ATPase proton pumping activity is required for adult zebrafish appendage regeneration[J]. PLoS One, 2014,9(3):e92594.

[9] Hucthagowder V, Morava E, Kornak U, et al. Loss-of-function mutations in ATP6V0A2 impair vesicular trafficking, tropoelastin secretion and cell survival[J]. Hum Mol Genet, 2009,18(12):2149-2165.

[10] McHenry P, Wang WL, Devitt E, et al. Iejimalides A and B inhibit lysosomal vacuolar H+-ATPase (V-ATPase) activity and induce S-phase arrest and apoptosis in MCF-7 cells[J]. J Cell Biochem, 2010,109(4):634-642.

[11] Parra KJ, Chan CY, Chen J. Saccharomyces cerevisiae Vacuolar H+-ATPase Regulation by Disassembly and Reassembly: One Structure and Multiple Signals[J]. Eukaryot Cell, 2014,13(6):706-714.

[12] Jefferies KC, Forgac M. Subunit H of the vacuolar (H+) ATPase inhibits ATP hydrolysis by the free V1 domain by interaction with the rotary subunit F[J]. J Biol Chem, 2008,283(8):4512-4519.

[13] Fischer B, Dimopoulou A, Egerer J, et al. Further characterization of ATP6V0A2-related autosomal recessive cutis laxa[J]. Hum Genet, 2012,131(11):1761-1773.

[14] Chung MI, Miao M, Stahl RJ, et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins[J]. Matrix Biol, 2006,25(8):492-504.

[15] Muizniek, LD, Cirulis JT, van der Horst A, et al. Modulated growth, stability and interactions of liquid-like coacervate assemblies of elastin[J]. Matrix Biol, 2014 Apr 12.

[16] Sommer N, Sattler M, Weise JM, et al. A tissue-engineered human dermal construct utilizing fibroblasts and transforming growth factor beta1 to promote elastogenesis[J]. Biotechnol J, 2013,8(3):317-326.

[17] Sproul EP, Argraves WA. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation[J]. Matrix Biol, 2013,32(2):86-94.

[18] Oh-Hashi, K, Kanamori Y, Hirata Y, et al. Characterization of V-ATPase inhibitor-induced secretion of cysteine-rich with EGF-like domains 2[J]. Cell Biol Toxicol, 2014,30(3):126-136.

[19] Wise SG, Weiss AS. Tropoelastin[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009,41(3):494-497.

[20] Sztul E, Lupashin V. Role of vesicle tethering factors in the ER-Golgi membrane traffic[J]. FEBS Lett, 2009,583(23):3770-3783.

[21] Rosnoblet C, Peanne R, Legrand D, et al. Glycosylation disorders of membrane trafficking[J]. Glycoconj J, 2013,30(1):23-31.

[22] Strasser B, Iwaszkiewicz J, Michielin O, et al. The V-ATPase proteolipid cylinder promotes the lipid-mixing stage of SNARE-dependent fusion of yeast vacuoles[J]. EMBO J, 2011,30(20):4126-4141.

[23] Kouwenberg D, Gardeitchik T, Mohamed M, et al. Wrinkled skin and fat pads in patients with ALG8-CDG: revisiting skin manifestations in congenital disorders of glycosylation[J]. Pediatr Dermatol, 2014,31(1):e1-e5.

[24] Dietz HC. TGF-beta in the pathogenesis and prevention of disease: a matter of aneurysmic proportions[J]. J Clin Invest, 2010,120(2):403-407.

[25] Urban Z, Hucthagowder V, Schürmann N, et al. Mutations in LTBP4 cause a syndrome of impaired pulmonary, gastrointestinal, genitourinary, musculoskeletal, and dermal development[J]. Am J Hum Genet, 2009,85(5):593-605.

[26] Hoyer J, Kraus C, Hammersen G, et al. Lethal cutis laxa with contractural arachnodactyly, overgrowth and soft tissue bleeding due to a novel homozygous fibulin-4 gene mutation[J]. Clin Genet, 2009,76(3):276-281.

[27] Annes JP, Munger JS, Rifkin DB. Making sense of latent TGFbeta activation[J]. J Cell Sci, 2003,116(Pt 2):217-224.

[28] Callewaert B, Renard M, Hucthagowder V. New insights into the pathogenesis of autosomal-dominant cutis laxa with report of five ELN mutations[J]. Hum Mutat, 2011,32(4):445-455.

[29] Katchman SD, Hsu-Wong S, Ledo I, et al. Transforming growth factor-beta up-regulates human elastin promoter activity in transgenic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,203(1):485-490.

[30] Zhang MC, Giro M, Quaglino D Jr, et al. Transforming growth factor-beta reverses a posttranscriptional defect in elastin synthesis in a cutis laxa skin fibroblast strain[J]. J Clin Invest, 1995,95(3):986-494.

[31] Papke CL,Yanagisawa H. Fibulin-4 and fibulin-5 in elastogenesis and beyond: Insights from mouse and human studies[J]. Matrix Biol, 2014 Mar 6.

[32] Chen G, Ghosh P, O′Farrell T, et al. Transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) suppresses growth of B-cell lymphoma cells by p14(ARF)-dependent regulation of mutant p53[J]. J Biol Chem, 2012,287(27):23184-23195.

[33] Janson D, Saintigny G, Zeypveld J, et al. TGF-beta1 induces differentiation of papillary fibroblasts to reticular fibroblasts in monolayer culture, but not in human skin equivalents[J]. Eur J Dermatol, 2014 Apr 11.

[34] Kornak U. Lessons from cutis laxa syndromes: wrinkles due to improper reloading of the extracellular matrix[J]? Eur J Hum Genet, 2009,17(9):1097-1098.

100144 北京，中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院 整形三科

李無言(1988-)，女，山東濟南人，碩士研究生.

王佳琦，100144，中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院 整形三科，電子信箱：wangjiaqi@psh.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.015

2014-04-16)