• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)及其意義

    2014-11-01 21:25:37姜會(huì)慶
    中國美容整形外科雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:基底膜平滑肌生長因子

    楊 靜, 姜會(huì)慶

    糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)及其意義

    楊 靜, 姜會(huì)慶

    目的初步探討結(jié)締組織生長因子在糖尿病外周血管病變發(fā)生過程中的作用。方法24只健康SD大鼠隨機(jī)分成糖尿病組(A組)和對照組(B組)。 A組腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型;12周后處死,取雙側(cè)股動(dòng)脈HE染色觀察管壁病變情況,免疫組織化學(xué)染色檢查CTGF在血管壁中的表達(dá)情況,電鏡觀察血管壁的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果①HE染色:血管管腔面積與血管外截面面積之比(ST),A組較B組降低(P<0.05)血管壁厚度與血管外徑之比(WT),A組較B組增加(P<0.05),提示A組管腔狹窄,血管順應(yīng)性降低。②免疫組化染色:A組CTGF表達(dá)呈陽性(+),并主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi);而B組大鼠外周血管CTGF表達(dá)基本呈陰性(-),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③電鏡觀察:A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞腫脹變形,體積增大,胞漿豐富,內(nèi)有發(fā)達(dá)的細(xì)胞器,以增生的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體為主,血管基底膜增厚。結(jié)論STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠外周血管在病程12周時(shí)出現(xiàn)了明顯的病理變化,包括動(dòng)脈管腔狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增生及血管基底膜增厚;同時(shí),CTGF在內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)出現(xiàn)顯著增強(qiáng),提示血管病變可能與CTGF表達(dá)增加有關(guān)。

    糖尿??; 鏈脲佐菌素; 外周血管病變; 結(jié)締組織生長因子

    糖尿病外周血管病變(peripheral vascular lesions, PVL)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,最常見于下肢血管,發(fā)病率為正常人群的4倍。據(jù)Walters等[1]報(bào)道,Ⅰ型糖尿病患者并發(fā)外周血管病變的發(fā)生率為8.7%,Ⅱ型糖尿病患者并發(fā)外周血管病變的發(fā)生率為23.5%。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是1988年由Almendral等[2]首先在小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種生長因子,被視為轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)的下游反應(yīng)元件,主要由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌,它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞有絲分裂,趨化細(xì)胞、誘導(dǎo)黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)產(chǎn)生。在皮膚、肺、腎等器官的纖維化過程中表達(dá)明顯增強(qiáng)[3]。2009年,筆者通過觀察STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠外周血管病變中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)與血管病變的情況,探討CTGF在糖尿病PVL發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義,了解PVL的發(fā)病機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康清潔級(jí)雌性SD大鼠24只,3個(gè)月齡,體質(zhì)量(150±20) g,由中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ;美國SIGMA公司),快速血糖試紙(美國強(qiáng)生公司),兔抗鼠CTGF單克隆抗體(美國 SANTA CRUZ 公司),超敏SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(南京宇盛達(dá)實(shí)業(yè)有限公司),鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

    1.2 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型制作 將24只大鼠隨機(jī)分成2組:糖尿病組(A組,n=12)和對照組(B組,n=12)。禁食10 h后,分別測定兩組大鼠體質(zhì)量及空腹血糖值,按STZ 60 mg/kg(60 ml/kg)空腹體質(zhì)量的劑量,一次性向A組大鼠腹腔內(nèi)注射STZ。B組大鼠僅給予0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液,腹腔注射60 ml/kg空腹體質(zhì)量。用藥72 h后大鼠尾靜脈采血測血糖,以隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L且能維持1周以上,確定為糖尿病大鼠模型建立標(biāo)準(zhǔn)。不能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者,72 h后補(bǔ)注STZ(以15 mg/kg空腹體質(zhì)量劑量,腹腔內(nèi)注射)。STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠成模后,每2周稱量大鼠體質(zhì)量,測隨機(jī)血糖,對不能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠和死亡大鼠,及時(shí)排除實(shí)驗(yàn)組并予以補(bǔ)充。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,不使用胰島素及其他降糖藥物。

    1.3 取材及標(biāo)本處理 STZ誘導(dǎo)成模后12周,稱量大鼠體質(zhì)量,測隨機(jī)血糖,禁食12 h后,以10%鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射,麻醉生效后立即處死大鼠,并迅速于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)上方1.0 cm至股動(dòng)脈起始處切取股動(dòng)脈,取該段股動(dòng)脈中段,長約0.5 cm的血管,常規(guī)HE染色、免疫組織化學(xué)染色及電鏡觀察。

    1.4 組織病理學(xué)觀察 ①數(shù)據(jù)采集。顯微鏡下觀察標(biāo)本血管病理改變情況,測量血管內(nèi)、外周長,計(jì)算血管內(nèi)(r)、外半徑(R)及血管截面積(S)和管腔面積(s),并由此計(jì)算血管壁厚度與血管外徑之比(WT,%)及管腔面積與血管截面積之比(ST,%),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。②免疫組化染色光鏡下觀察。陽性細(xì)胞為棕黃色著色,結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩個(gè)方面,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的分析。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)包括血管內(nèi)膜及平滑肌層全層的高倍視野(×400),對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),取其平均值再結(jié)合染色強(qiáng)度,作為該標(biāo)本的陽性染色結(jié)果,(-)為未見陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞數(shù)<30%,陽性染色弱;(+)為陽性細(xì)胞數(shù)≥30%,陽性染色強(qiáng)。③電鏡下觀察。在透射電鏡下觀察超薄切片(×106)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞變化情況及基底膜厚度改變。

    2 結(jié)果

    A組較B組血管管腔狹窄,管壁增厚,差異顯著。染色結(jié)果:A組出現(xiàn)管腔狹窄、內(nèi)膜皺褶;平滑肌細(xì)胞胞核及胞漿淡染,核周出現(xiàn)空泡樣改變,細(xì)胞肥大,胞漿豐富,基底膜增厚明顯,血管壁較對照組增厚(圖1a)。B組動(dòng)物的股動(dòng)脈HE染色顯示,組織結(jié)構(gòu)正常,血管壁較薄,血管基底膜較薄(圖1b)。

    數(shù)據(jù)測定:HE染色的切片顯微鏡下拍照,因血管為空腔臟器,面積可因擠壓、塌陷等原因發(fā)生改變,而血管周徑相對恒定,因此,選擇人工定位血管周徑,計(jì)算機(jī)測量血管內(nèi)、外周徑(L,l),計(jì)算出血管管腔面積、血管外橫截面面積(S、s)。根據(jù)測量結(jié)果,計(jì)算管腔面積與血管外截面面積之比(ST),兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差分析(表1)。

    圖1 兩組大鼠股動(dòng)脈形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE ×40) a. A組股動(dòng)脈:血管管徑狹窄,血管壁明顯增厚 b. B組股動(dòng)脈:血管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,血管壁較薄

    Fig1 Changes of femoral arteries in two group of rats (HE ×40).

    a. the femoral artery with narrowed vessel and thickened vessel wall.b. the normal femoral artery with thinner vessel wall in group B.

    A組較B組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá),差異顯著。對免疫組織化學(xué)染色,染色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒,主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿區(qū),陰性對照無棕黃色著色。觀察發(fā)現(xiàn),12周時(shí)B組偶可見少量散在棕黃色著色,大部分檢查結(jié)果為陰性;A組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿區(qū)可見大量棕黃色陽性著色區(qū),大部分檢查結(jié)果為陽性。對染色結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),A組與B組比較P<0.01,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。CTGF免疫組化染色陰性對照。

    A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變:電鏡下觀察B組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,無明顯改變;A組血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞腫脹變形,體積增大,胞漿豐富,內(nèi)有發(fā)達(dá)的細(xì)胞器,以增生的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體為主,血管基底膜增厚,提示合成、分泌活躍。

    表1 兩組大鼠股動(dòng)脈ST和WT的比較

    注:與B組相比較,*P<0.01,**P<0.05

    表2 兩組大鼠股動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的比較

    Tab 2 Comparison of IHC results in the two groups n=12

    注:P<0.01

    3 討論

    引起糖尿病血管損傷的機(jī)制有很多,通過對糖尿病腎病及糖尿病性視網(wǎng)膜病變的研究[4-5]證實(shí),高血糖通過激活蛋白激酶C(PKC),增加TGF-β的產(chǎn)生,可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加,血管基底膜增厚,引起血流障礙。作為TGF-β的下游因子,結(jié)締組織生長因子是一個(gè)重要的促組織纖維化蛋白,在TGF-β刺激下成纖維細(xì)胞能夠長時(shí)間產(chǎn)生高水平的CTGF,直接或間接增強(qiáng)纖維連接蛋白、各型膠原和整合素等ECM成分的產(chǎn)生[6],而利用CTGF中和抗體卻能夠明顯減輕TGF-β所誘導(dǎo)的膠原合成[7]。Wang等[8]通過研究證實(shí),應(yīng)用CTGFsiRNA可有效抑制TGF-β1介導(dǎo)的豬成纖維細(xì)胞的CTGF及ECM的表達(dá)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示我們,如能阻抑CTGF表達(dá)將有望阻斷或減少由TGF-β過表達(dá)導(dǎo)致血管基底膜的增厚,從而阻止或減緩糖尿病外周血管病變的發(fā)生及發(fā)展。

    正常組織內(nèi)各種管腔內(nèi)皮細(xì)胞均可產(chǎn)生CTGF,且CTGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞呈原位表達(dá),可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖、遷移,并呈劑量依賴性。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的功能,主要是通過收縮和舒張來維持血管壁的張力,通過增生和產(chǎn)生ECM來維持血管的完整性,其增殖、遷移可導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成,這在血管損傷修復(fù)形成和發(fā)展的過程中起到了關(guān)鍵性的作用[9]。2008年,有學(xué)者通過下調(diào)CTGF表達(dá),抑制了VSMC的增殖和遷移[10],證實(shí)了CTGF對VSMC的作用。研究者們通過RNA干擾靶向抑制了CTGF后發(fā)現(xiàn),血管平滑肌細(xì)胞分泌下游纖維化因子的過程被阻抑,有效干預(yù)了血管纖維化的過程[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn), CTGF在誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化和鈣化中,發(fā)揮了重要作用,可能通過誘導(dǎo)VSMC轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞而促進(jìn)血管鈣化[12]。在本次實(shí)驗(yàn)中,A組血管壁中有明顯CTGF的表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿區(qū)可見大量棕黃色陽性著色區(qū),提示CTGF在細(xì)胞內(nèi)呈過表達(dá)。電鏡結(jié)果顯示,正是在上述區(qū)域內(nèi)血管壁出現(xiàn)了明顯病理性改變。

    本研究中,我們以STZ腹腔注射SD大鼠,成功建立糖尿病模型。在病程12周時(shí)光學(xué)顯微鏡及電鏡下呈現(xiàn)明顯外周血管病變,管壁粗糙,管腔狹窄,血管內(nèi)皮皺褶,內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增生和(或)肥大及ECM沉積、基底膜增厚,說明糖尿病外周血管病變已發(fā)生,且免疫組化顯示,CTGF在上述病理改變部位即血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)明顯增高。目前的研究顯示,CTGF在糖尿病腎病早期即出現(xiàn)表達(dá)明顯增高[13],且在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中,CTGF的產(chǎn)生早于微循環(huán)血管的改變[14]。上述研究結(jié)果提示,CTGF有可能在早期通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化及促進(jìn)ECM的產(chǎn)生等途徑,參與了糖尿病外周血管病變發(fā)生及發(fā)展過程。CTGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能是糖尿病外周血管病變發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。但其具體作用機(jī)制及能否通過阻斷CTGF途徑來改善糖尿病外周血管病變的發(fā)生、發(fā)展,尚有待進(jìn)一步研究。

    [1] Walters DP, Gatling W, Mullee MA, et al. The prevalence、detection、and epidemiological correlates of peripheral vascular disease: a comparison of diabetic and non-diabetic subjects in an English community[J]. Diabet Med, 1992,9(8):710-715.

    [2] Almendral JM, Sommer D, Macdonald-Bravo H, et al. Complexity of the early genetic response to growth factors in mouse fibroblasts[J]. Mol Cell Biol, 1988,8(5):2140-2148.

    [3] Ito Y, Aten J, Nguyen TQ. Involvement of connective tissue growth factor in human and experimental hypertensive nephrosclerosis[J]. Nephron Exp Nephrol, 2011,117(1):e9-e20.

    [4] Wang S, Denichilo M, Brubaker C, et al. Connective tissue growth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2001,60(1):96-105.

    [5] Tikellis C, Cooper M, Twigg SM, et al. Connective tissue growth factor is up-regulated in the diabetic retina: amelioration by angiotensin-converting enzyme inhibition[J]. Endocrinology, 2004,145(2):860-866.

    [6] Moussad EE, Rageh MA, Wilson AK, et al. Temporal and spatial expression of connective tissue growth factor (CCN2;CTGF) and transforming growth factor beta type1 (TGF-βeta1) at the uteroplacental interface during early pregnancy in the pig[J]. Mol Pathol, 2002,55(3):186-192.

    [7] Ruperez M, Lorenzo O, Blanco-Colio LM, et al. Connective tissue growth factor is a mediator of angiotensⅡ-induced fibrosis[J]. Circulation, 2003,108(12):1499-1505.

    [8] Wang JF, Olson ME, Ma L, et al. Connective tissue growth factor siRNA modulates mRNA levels for a subset of molecules in normal and TGF-beta1-stimulated porcine skin fibroblasts[J]. Wound Repair Regen, 2004,12(2):205-216.

    [9] Ohtsuka M, Miyashita Y, Shirai K. Lipids deposited in human atheromatous lesions induce apoptosis of human vascular smooth muscle cells[J]. J Atheroscler Thromb, 2006,13(5):256-262.

    [10] 霍曉川, 羅俊生, 孫霄云, 等. CTGF反義RNA對血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008,29(1):4-6.

    [11] 閡新文, 郎明健, 楊漢東, 等. RNA干擾選擇性下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞結(jié)締組織生長因子的表達(dá)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007,11(49):9842-9846.

    [12] 彭依群, 黃 娟, 黃 漢, 等. 結(jié)締組織生長因子對體外培養(yǎng)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2013,29(1):64-68.

    [13] 于 倩, 張 沫, 劉德敏. TGF-β1、CTGF基因的過表達(dá)與早期糖尿病腎病關(guān)系的研究[J]. 天津醫(yī)藥, 2012,40(3):262-265.

    [14] 胡艷濱, 張靜楷, 孫智勇, 等. 實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和微血管改變及結(jié)締組織生長因子的表達(dá)[J]. 中華眼科雜志, 2011,(6):521-526.

    Expressionofconnectivetissuegrowthfactorintheperipheralvascularlesionsofdiabeticratanditssignificance

    YANGJing,JIANGHui-qing.

    (DepartmentofBurnandPlasticSurgery,AnhuiSecondProvincialPeople′sHospital,Hefei230011,China)

    ObjectiveTo observe the effect of connective tissue growth factor (CTGF) on the development of peripheral vascular lesions of diabetes.MethodsTwenty-four Sprague-Dawley rats were divided randomly into Diabetes Mellitus group (A,n=12) and Normal Control group (B,n=12). Streptozotocin was injected intraperitoneally into the rats in group A to establish the model of diabetic rats. At the 12th week, the rats were sacrificed and their femoral artery were harvested. HE stain, immunohistochemistry stain and electron microscope were applied to observe the pathologic structure, the expression of CTGF and ultrastructure of femoral artery, respectively.Results①HE staining: the ratio of the area of vessel lumen and that of whole vessel in group A was obviously lower than that in group B (P<0.05). Accordingly, the ratio of the thickness of vessel wall and the radius of whole vessel in group A was obviously higher than that in group B (P<0.05). These results suggested that the vessel lumen in group A became stenotic and the vessel compliance decreased. ②Immunohistochemistry staining: In group A, CTGF was expressed in vascular endothelial cells and smooth muscle cells. In group B, the expression of CTGF was almost absent. The difference was much significant (P<0.01). ③Electron microscope: Swelling, enlargement, deformity and hyperplasia of cytoplasm and endoplasmic reticulum were observed in both endothelial cells and smooth muscle cells. The basement membrane also became thick.ConclusionEvident peripheral vascular lesions were observed in streptozotocin-induced diabetic rats, described as follows: Stenosis of vessel lumen, impairment of vascular endothelial cells, hypertrophy of smooth muscle cells, hyperplasia of extra cellular matrix and thickening of basement membrane, at the same time, the expression of CTGF in group A was obviously elevated, which suggested the possible relation between the peripheral vascular lesions and the expression of CTGF.

    Diabetes mellitus; Streptozotocin; Peripheral vascular lesions; Connective tissue growth factor

    230011 安徽 合肥,安徽省第二人民醫(yī)院 燒傷整形科(楊 靜);南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 燒傷整形科(姜會(huì)慶)

    楊 靜(1978-),女,安徽宣城人,主治醫(yī)師,碩士.

    10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.019

    R-322

    A

    1673-7040(2014)08-0502-05

    2014-03-06)

    猜你喜歡
    基底膜平滑肌生長因子
    新生小鼠耳蝸基底膜的取材培養(yǎng)技術(shù)*
    原發(fā)性腎上腺平滑肌肉瘤1例
    喉血管平滑肌瘤一例
    豚鼠耳蝸基底膜響應(yīng)特性的實(shí)驗(yàn)測試與分析
    Fibulin-2在診斷乳腺基底膜連續(xù)性的準(zhǔn)確性研究
    腸系膜巨大平滑肌瘤1例并文獻(xiàn)回顧
    鼠神經(jīng)生長因子對2型糖尿病相關(guān)阿爾茨海默病的治療探索
    胃癌組織中成纖維細(xì)胞生長因子19和成纖維細(xì)胞生長因子受體4的表達(dá)及臨床意義
    鼠神經(jīng)生長因子修復(fù)周圍神經(jīng)損傷對斷掌再植術(shù)的影響
    咽旁巨大平滑肌肉瘤一例MRI表現(xiàn)
    另类精品久久| av在线app专区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产在线一区二区三区精| 97超碰精品成人国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产极品粉嫩免费观看在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 麻豆乱淫一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 满18在线观看网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品一二三| 国产精品久久久久久久电影| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲色图综合在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 精品久久国产蜜桃| 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久久久久久免| 少妇高潮的动态图| 精品一区二区免费观看| av电影中文网址| 亚洲图色成人| 五月开心婷婷网| 男女边摸边吃奶| 大片电影免费在线观看免费| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩视频在线欧美| 久久久亚洲精品成人影院| 高清av免费在线| 久久精品国产综合久久久 | 国产成人91sexporn| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 蜜桃国产av成人99| 免费大片黄手机在线观看| 午夜av观看不卡| 亚洲国产精品一区三区| 三级国产精品片| 免费看不卡的av| 男女边摸边吃奶| 一级毛片电影观看| 97人妻天天添夜夜摸| h视频一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 在线观看三级黄色| 少妇 在线观看| 午夜视频国产福利| 黄片无遮挡物在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲精品一区蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人91sexporn| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久精品国产a三级三级三级| 看十八女毛片水多多多| 一区二区av电影网| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产有黄有色有爽视频| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人添女人高潮全过程视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲情色 制服丝袜| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 五月伊人婷婷丁香| 一级,二级,三级黄色视频| 日本午夜av视频| 亚洲av.av天堂| 欧美另类一区| 一二三四中文在线观看免费高清| 一本久久精品| 国产乱来视频区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | freevideosex欧美| 综合色丁香网| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 看免费成人av毛片| 成人手机av| 丝袜人妻中文字幕| 丰满少妇做爰视频| 亚洲欧洲日产国产| 国精品久久久久久国模美| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲经典国产精华液单| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久久精品久久久久真实原创| 大香蕉97超碰在线| 日韩电影二区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美成人午夜免费资源| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久99热这里只频精品6学生| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 国产色爽女视频免费观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产一区亚洲一区在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久99热6这里只有精品| 99re6热这里在线精品视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久久精品国产国产毛片| 青春草视频在线免费观看| 欧美精品一区二区大全| 日本av手机在线免费观看| 国产爽快片一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产男人的电影天堂91| 最近2019中文字幕mv第一页| 五月开心婷婷网| 亚洲成国产人片在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 少妇的逼水好多| 久久这里只有精品19| 丝袜在线中文字幕| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩成人av中文字幕在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 精品少妇久久久久久888优播| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 久久久a久久爽久久v久久| 免费在线观看完整版高清| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费观看a级毛片全部| 午夜久久久在线观看| 午夜福利视频精品| 丝袜在线中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产成人av激情在线播放| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 插逼视频在线观看| 一级a做视频免费观看| 久久久精品区二区三区| 全区人妻精品视频| 黄片播放在线免费| av在线老鸭窝| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本91视频免费播放| 香蕉丝袜av| 欧美另类一区| videos熟女内射| 国产精品 国内视频| 天堂8中文在线网| 亚洲伊人色综图| 亚洲一码二码三码区别大吗| 91精品国产国语对白视频| av在线老鸭窝| 久久精品国产自在天天线| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久精品人妻al黑| 中国三级夫妇交换| 在线观看www视频免费| 久久久国产精品麻豆| 精品久久蜜臀av无| 国产69精品久久久久777片| 黄色一级大片看看| av一本久久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 一级片免费观看大全| 综合色丁香网| 久久这里有精品视频免费| 69精品国产乱码久久久| 高清欧美精品videossex| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人国产av品久久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久精品人妻al黑| 精品久久国产蜜桃| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片我不卡| 考比视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 欧美成人午夜精品| 大陆偷拍与自拍| 国产视频首页在线观看| 国产高清三级在线| 看非洲黑人一级黄片| av女优亚洲男人天堂| 免费大片黄手机在线观看| 777米奇影视久久| 免费看av在线观看网站| 国产福利在线免费观看视频| 9191精品国产免费久久| 国产成人一区二区在线| 九色成人免费人妻av| 国产成人欧美| 最新的欧美精品一区二区| 大片免费播放器 马上看| 99久久人妻综合| 亚洲丝袜综合中文字幕| 五月天丁香电影| 飞空精品影院首页| 久久久久久久久久久免费av| 在线观看三级黄色| 亚洲伊人色综图| 2022亚洲国产成人精品| 热99国产精品久久久久久7| 捣出白浆h1v1| 精品一区在线观看国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 制服诱惑二区| 一级黄片播放器| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲图色成人| 只有这里有精品99| 日韩 亚洲 欧美在线| 色94色欧美一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 美女中出高潮动态图| 欧美日韩精品成人综合77777| 曰老女人黄片| 国产有黄有色有爽视频| 美女福利国产在线| 国产探花极品一区二区| 亚洲国产精品一区三区| 少妇的逼水好多| 日日撸夜夜添| 熟妇人妻不卡中文字幕| av免费观看日本| 9热在线视频观看99| 亚洲经典国产精华液单| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产成人精品久久久久久| 久久青草综合色| 国产av一区二区精品久久| 一级毛片 在线播放| 国产成人欧美| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品第二区| 大陆偷拍与自拍| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 婷婷色av中文字幕| 久久99蜜桃精品久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99视频精品全部免费 在线| 9色porny在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久国产一区二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 日本av免费视频播放| 丝袜脚勾引网站| 九九在线视频观看精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 一区二区av电影网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久久久网色| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲 欧美一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 国产精品人妻久久久影院| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲图色成人| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 波野结衣二区三区在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| a级片在线免费高清观看视频| 黑人高潮一二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 日本黄色日本黄色录像| 久久久精品免费免费高清| 黄色一级大片看看| 视频在线观看一区二区三区| 国产片内射在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产成人91sexporn| a级毛片黄视频| 日日啪夜夜爽| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 97在线视频观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品少妇内射三级| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲内射少妇av| av女优亚洲男人天堂| 日韩一区二区视频免费看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美人与善性xxx| a级毛片在线看网站| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲美女搞黄在线观看| 在线天堂最新版资源| 一边亲一边摸免费视频| 另类精品久久| 最近中文字幕2019免费版| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产精品成人久久小说| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲精品视频女| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品国产av在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲,一卡二卡三卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| av网站免费在线观看视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 自线自在国产av| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲色图综合在线观看| 日本欧美视频一区| 国产精品一国产av| 久久午夜福利片| 久久久精品免费免费高清| 最新中文字幕久久久久| 国产亚洲精品久久久com| a级片在线免费高清观看视频| 日韩大片免费观看网站| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲国产av新网站| 亚洲少妇的诱惑av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 一边亲一边摸免费视频| 午夜福利乱码中文字幕| av一本久久久久| 日韩一区二区视频免费看| 日韩av免费高清视频| 免费黄频网站在线观看国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区二区av电影网| 91成人精品电影| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产色片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日本中文国产一区发布| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久精品夜色国产| 老司机影院毛片| 国产片内射在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 男的添女的下面高潮视频| 99久久综合免费| 另类亚洲欧美激情| www.色视频.com| 人妻系列 视频| 国产免费福利视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 91成人精品电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产一级毛片在线| 国产黄色免费在线视频| 国产乱来视频区| 大香蕉久久成人网| 婷婷色av中文字幕| 制服诱惑二区| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩伦理黄色片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美日韩亚洲高清精品| 少妇人妻 视频| 国产在线一区二区三区精| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 丁香六月天网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产激情久久老熟女| 人妻 亚洲 视频| 色哟哟·www| 久热这里只有精品99| 丰满乱子伦码专区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 成人免费观看视频高清| 午夜91福利影院| 国产av码专区亚洲av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一级,二级,三级黄色视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| av播播在线观看一区| 18禁动态无遮挡网站| 国产一区二区在线观看av| 亚洲少妇的诱惑av| 国产男女内射视频| 免费看不卡的av| 午夜免费鲁丝| 精品酒店卫生间| 精品久久久精品久久久| 国产福利在线免费观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩亚洲高清精品| av片东京热男人的天堂| 精品视频人人做人人爽| 中国国产av一级| 亚洲久久久国产精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 女性生殖器流出的白浆| 热99国产精品久久久久久7| 成人毛片a级毛片在线播放| 一二三四在线观看免费中文在 | 美女国产高潮福利片在线看| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久精品久久久久久久性| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品国产a三级三级三级| 七月丁香在线播放| 在线观看免费视频网站a站| 在线观看国产h片| 捣出白浆h1v1| 亚洲国产精品999| 免费大片18禁| 黑丝袜美女国产一区| 欧美人与性动交α欧美软件 | 另类精品久久| 少妇人妻 视频| 一级爰片在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人一区二区在线| 热re99久久国产66热| 中文字幕人妻丝袜制服| 麻豆乱淫一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品.久久久| av国产精品久久久久影院| 国产在线视频一区二区| 高清不卡的av网站| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 最黄视频免费看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久视频综合| 18禁国产床啪视频网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 晚上一个人看的免费电影| 少妇人妻久久综合中文| 赤兔流量卡办理| 黄片播放在线免费| 熟女电影av网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美日韩精品成人综合77777| 99久久人妻综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产成人av激情在线播放| av有码第一页| 在线 av 中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 91成人精品电影| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲性久久影院| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久伊人网av| 考比视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 秋霞在线观看毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 美女中出高潮动态图| 中国国产av一级| 久久国产精品大桥未久av| 老司机影院成人| 超色免费av| 99久久人妻综合| 国产男女内射视频| 国产一区二区激情短视频 | 欧美97在线视频| 久久ye,这里只有精品| 伦理电影大哥的女人| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品 国内视频| 中文字幕免费在线视频6| xxx大片免费视频| 亚洲久久久国产精品| 一级毛片我不卡| 男女啪啪激烈高潮av片| av线在线观看网站| 少妇的逼好多水| 久久久久国产网址| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产极品天堂在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美国产精品一级二级三级| 十八禁网站网址无遮挡| 国产在视频线精品| 91国产中文字幕| 亚洲伊人色综图| 国产视频首页在线观看| 国产精品.久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久热这里只有精品99| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩大片免费观看网站| 亚洲,欧美精品.| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中文字幕制服av| 久久久国产一区二区| 久久久久久久久久成人| 2021少妇久久久久久久久久久| 日本与韩国留学比较| 精品人妻一区二区三区麻豆| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 九九在线视频观看精品| 另类精品久久| 成人国语在线视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 一本久久精品| 亚洲天堂av无毛| 日本91视频免费播放| 国产成人av激情在线播放| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av综合色区一区| 成人国产av品久久久| 少妇精品久久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 婷婷成人精品国产| 国产一区二区在线观看av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩av免费高清视频| 不卡视频在线观看欧美| 黄色视频在线播放观看不卡| av免费观看日本| 午夜免费观看性视频| 久久青草综合色| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久久久人妻| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费高清在线观看日韩| 最近的中文字幕免费完整| 色婷婷av一区二区三区视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 春色校园在线视频观看| av播播在线观看一区| 亚洲三级黄色毛片| 国产免费视频播放在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 另类精品久久| 国产男人的电影天堂91| 国产在线免费精品| 99热6这里只有精品| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久久久久久成人| 国内精品宾馆在线| 日韩伦理黄色片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品视频人人做人人爽| 丝袜美足系列| 香蕉国产在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产探花极品一区二区| a级毛片黄视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久精品性色| 国产成人免费观看mmmm| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一本久久精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 热99久久久久精品小说推荐| 99久国产av精品国产电影| 日韩精品有码人妻一区| 免费看不卡的av| 成年人午夜在线观看视频| 最新中文字幕久久久久|