牛黃鎮(zhèn)驚丸中黃曲霉毒素殘留檢測(cè)方法研究

劉雅丹,李靜,張聿梅,王菲菲,于欣

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

動(dòng)物源性或植物源性中藥在生長(zhǎng)、加工、貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中均可能被真菌污染[1]。其中，黃曲霉是我國(guó)糧食和飼料中常見(jiàn)的真菌，它的次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)，具有致癌、致畸、致突變和強(qiáng)烈的肝臟毒性[2-4]。黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前毒性最強(qiáng)、分布最廣、含量最高的Ⅰ類(lèi)致癌物，它可以通過(guò)食物鏈在生物體之間轉(zhuǎn)移，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害[4]。中藥材主要來(lái)源于天然產(chǎn)物，不可避免地會(huì)感染黃曲霉。一般認(rèn)為，動(dòng)物源性中藥材受潮霉變的概率高于植物源性中藥材[2]。因此，檢測(cè)動(dòng)物源性中藥材或含動(dòng)物源性中成藥中黃曲霉毒素的殘留量，對(duì)于確保臨床用藥安全至關(guān)重要。在《中國(guó)藥典》2015年版(一部)中，陳皮、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎、僵蠶等20余味藥材及其飲片均有黃曲霉毒素的檢查項(xiàng)，其要求為： AFB1含量不得超過(guò)5 μg·kg-1,B1、B2、G1和G2總含量不得超過(guò)10 μg·kg-1[7]。

牛黃鎮(zhèn)驚丸(大蜜丸)是一種常見(jiàn)的中成藥制劑，收載于《中國(guó)藥典》年版2015年版(一部)，處方由牛黃、全蝎、炒僵蠶、天麻、鉤藤、防風(fēng)、膽南星、制白附子、天竺黃、薄荷和甘草等十八味中藥材原料組成，臨床主要治療小兒驚風(fēng)，高熱抽搐，煩躁不安等癥狀[7]。本文針對(duì)牛黃鎮(zhèn)驚丸中動(dòng)物源性和植物源性中藥材進(jìn)行黃曲霉毒素檢測(cè)，評(píng)估牛黃鎮(zhèn)驚丸的黃曲霉毒素殘留的風(fēng)險(xiǎn)。

目前針對(duì)中藥中黃曲霉毒素檢測(cè)的方法，主要為薄層色譜法、免疫親和柱-高效液相色譜方法(IAC-HPLC)、液相串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等[1,5]。然而，這些方法操作較為復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和操作人員完成試驗(yàn)。為了適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢查的需要，本文采用免疫膠體金方法(GICA)對(duì)牛黃鎮(zhèn)驚丸樣品的黃曲霉毒素的殘留量進(jìn)行快速篩查。GICA方法可以在非實(shí)驗(yàn)室條件下簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)樣品中真菌毒素的殘留量，已在食品和飼料行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[9]。

本文采用GICA方法對(duì)8批次牛黃震驚丸中黃曲霉毒素的殘留量進(jìn)行測(cè)定，采用IAC-HPLC方法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛黃震驚丸樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，降低了樣品本底對(duì)GICA方法和IAC-HPLC方法的干擾。試驗(yàn)對(duì)測(cè)定方法的適用性進(jìn)行確認(rèn)，為中藥復(fù)方制劑黃曲霉毒素測(cè)定提供了技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

Waters e2695分析型高效液相色譜儀，包括Waters 2475 熒光檢測(cè)器 (美國(guó)Waters公司)；光化學(xué)衍生器(美國(guó)AURA公司,反應(yīng)線圈15 m，燈管254 nm)。Cloversil C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；AE 240 型十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士Mettler 公司)；Z2064 離心機(jī)(德國(guó)Hermle公司)；IAC-SEP黃曲霉毒素總量免疫親和柱；iCheck食品安全定量快檢儀；iCheck總黃曲霉毒素定量快檢試劑盒(中藥，產(chǎn)品號(hào)：CS101-J)、黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自北京中檢維康技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈(美國(guó)Thermo Fisher公司，色譜純)；樣品處理及溶液配制中使用的超純水由Mini-Q超純水處理系統(tǒng)制備(美國(guó)Millipore公司)。牛黃鎮(zhèn)驚丸及處方藥材和飲片均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 混合對(duì)照溶液 精密吸取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品(黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2標(biāo)示濃度分別為1.0、0.3、1.0和0.3 μgmL-1)0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液 GICA法：取牛黃鎮(zhèn)驚丸樣品(用手術(shù)剪剪碎成約2 mm3塊狀)，稱(chēng)取5.0 g于50 mL離心管中，加入70%甲醇溶液25.0 mL，置于旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩提取10 min，用定性濾紙過(guò)濾，即得。

HPLC法取牛黃鎮(zhèn)驚丸樣品(用手術(shù)剪剪碎成約2 mm3塊狀)，稱(chēng)取粉末樣品15 g置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min(11 000 r·min-1)，離心5 min(2 500 r·min-1)，精密量取上清15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻(稀釋試驗(yàn)中，精密量取上清15 mL，置250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻)。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，量取續(xù)濾液20.0 mL，通過(guò)免疫親和柱，流速3 mL·min-1，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 檢測(cè)方法 GICA法：從試劑盒中取出相應(yīng)定量快檢卡和黃曲霉毒素稀釋緩沖液，平衡至室溫，將快iCheck食品安全定量快檢儀自帶的零點(diǎn)校正片插入定量快檢儀測(cè)定室，進(jìn)行“零點(diǎn)校正”；將使用相應(yīng)批次的快檢卡二維碼輸入到iCheck食品安全定量快檢儀中，獲取校準(zhǔn)曲線。將外包裝打開(kāi)，取出相應(yīng)微孔固定于微孔架上，快檢卡放置于37 ℃恒溫器上。取黃曲霉毒素稀釋緩沖液120 μL于相應(yīng)微孔中，加入供試品溶液30 μL，用移液器吸打5次混勻，取100 μL加入快檢卡樣品孔中。37 ℃反應(yīng)10 min后，立即將快檢卡放入定量快檢儀中，點(diǎn)擊“檢測(cè)分析”讀數(shù)，即為樣品實(shí)際濃度。

IAC-HPLC法：色譜條件：采用Cloversil C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)，以甲醇-水(45∶55)為流動(dòng)相，流速0.8 mLmin-1，檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)λex=360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=440 nm，進(jìn)樣量20 μL，光化學(xué)衍生化系統(tǒng)為光化學(xué)衍生器 (連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測(cè)器)。

2.3 樣品測(cè)定

2.3.1 GICA方法學(xué)驗(yàn)證及樣品測(cè)定

2.3.1.1 空白對(duì)照 按處方量配置不含全蝎和炒僵蠶的牛黃震驚丸空白樣品，按照“2.1.2” 項(xiàng)下GICA法提取，即得，空白對(duì)照在GICA方法中無(wú)黃曲霉毒素檢出。

2.3.1.2 隨行回收率試驗(yàn) 抽取3個(gè)批次樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，編號(hào)為A、B和C，使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在供試品溶液中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測(cè)試溶液。按“2.2”項(xiàng)下GICA法進(jìn)行測(cè)定，每批次樣品平行重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)表1。其中B和C 2份樣品本底有少量黃曲霉毒素B1檢出，含量不高于中國(guó)藥典限量。樣品回收率在96.8%～130.2%之間，其余批次樣品均無(wú)黃曲霉毒素檢出。

表1 GICA法檢測(cè)牛黃鎮(zhèn)驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3.2 IAC-HPLC方法學(xué)驗(yàn)證及樣品測(cè)定 采用隨行質(zhì)量控制(包括隨行空白試驗(yàn)和隨行回收率試驗(yàn))確認(rèn)方法的適用性。

2.3.2.1 檢測(cè)限 取混合對(duì)照溶液，進(jìn)樣量2 μL，計(jì)算黃曲霉毒素B1峰信噪比為10，本試驗(yàn)檢測(cè)限為黃曲霉毒素B10.4 μg·kg-1，黃曲霉毒素總量0.4 μg·kg-1。

2.3.2.2 空白對(duì)照 按處方量配置不含全蝎和炒僵蠶的牛黃震驚丸空白樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下 IAC-HPLC法提取，即得，空白對(duì)照在IAC-HPLC方法中無(wú)黃曲霉毒素檢出。

2.3.2.3 隨行回收率試驗(yàn) 將A、B和C 3批次樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在供試品溶液中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測(cè)試溶液。按“2.2”項(xiàng)下 IAC-HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，每批次樣品平行重復(fù)3次，計(jì)算黃曲霉毒素B1回收率結(jié)果見(jiàn)表2。3份樣品回收率在46.6%～67.7%之間。所有樣品未檢出B1、B2、G1和G2黃曲霉毒素。

表2 IAC-HPLC方法檢測(cè)牛黃鎮(zhèn)驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3.3 樣品稀釋的IAC-HPLC方法學(xué)驗(yàn)證和黃曲霉毒素檢測(cè) 由“2.3.2”項(xiàng)下可知，采用IAC-HPLC方法對(duì)直接進(jìn)樣的牛黃鎮(zhèn)靜丸樣品黃曲霉毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明A、B和C 3份樣品的回收率均較低。分析原因，可能是由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜，本底干擾較為嚴(yán)重，使得測(cè)定結(jié)果回收率下降。試驗(yàn)中將樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)在提取樣品時(shí)采用5倍稀釋時(shí)，本底干擾明顯降低。本節(jié)對(duì)稀釋后的供試樣品進(jìn)行方法學(xué)研究。

2.3.3.1 檢測(cè)限 結(jié)果同“2.3.2.1”項(xiàng)下。

2.3.3.2 空白對(duì)照 結(jié)果同“2.3.2.2” 項(xiàng)下。

2.3.3.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照溶液2、4、6、8、10和20 μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖。以AFB1濃度(ngmL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.656X-0.436,r2=0.998 1。AFB1在4～20 ngmL-1之間線性關(guān)系良好。

2.3.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，精密度RSD在0.98%～1.55%之間，表明本試驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一牛黃震驚丸樣品，按供試樣品溶液制備方法重復(fù)檢測(cè)6次，記錄色譜圖，計(jì)算RSD為0.20%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3.6 回收率試驗(yàn) 將A、B和C 3批次樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在供試品溶液中加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度分別為0、5、10、20 μg·kg-1的測(cè)試溶液。按“2.2”項(xiàng)下IAC-HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，每批次樣品平行重復(fù)3次，計(jì)算AFB1回收率結(jié)果見(jiàn)表3。3份樣品回收率在80.7%～94.0%之間。所有樣品未檢出B1、B2、G1和G2黃曲霉毒素殘留。

表3 IAC-HPLC法檢測(cè)牛黃鎮(zhèn)驚丸中黃曲霉毒素回收率試驗(yàn)結(jié)果(×5)(n=3)

①A樣品加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為5 μg·kg-1；②A樣品稀釋后加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為5 μg·kg-1；③A樣品；④G1、B1、G2和B2黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液圖1 牛黃鎮(zhèn)靜丸中黃曲霉殘留檢測(cè)HPLC圖

3 討論

本試驗(yàn)采用了GICA和IAC-HPLC方法，對(duì)牛黃鎮(zhèn)驚丸的黃曲霉毒素殘留進(jìn)行檢測(cè)，僅GICA方法中檢出2批次樣品有黃曲霉毒素AFB1殘留，且均低于試劑盒定量限(檢出限：1 μgkg-1，定量限：3 μgkg-1)。8批次樣品黃曲霉毒素殘留量符合《中國(guó)藥典》黃曲霉毒素限量規(guī)定。由于動(dòng)物源性中藥材全蝎和僵蠶容易感染黃曲霉，本文使用去除全蝎和僵蠶的樣品作為空白對(duì)照。為了排除輔料的干擾，本文前期試驗(yàn)也對(duì)各種蜂蜜(包括棗花蜜、桂花蜜和白花蜜等)和煉蜜進(jìn)行考察，所有蜂蜜IAC-HPLC檢測(cè)無(wú)任何信號(hào)檢出，表明蜂蜜對(duì)免疫膠體金反應(yīng)沒(méi)有干擾。

采用IAC-HPLC方法對(duì)牛黃震驚丸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品回收率較低，不能滿足黃曲霉毒素殘留測(cè)定的要求。分析可能的原因?yàn)榕｜S震驚丸復(fù)方制劑中藥原料藥所含成分對(duì)IAC-HPLC測(cè)定結(jié)果有一定的干擾性。試驗(yàn)表明，用對(duì)牛黃震驚丸樣品進(jìn)行前處理中進(jìn)行5倍稀釋?zhuān)擅黠@提高待測(cè)樣品的回收率。采用IAC-HPLC方法檢測(cè)樣品，8批次樣品均無(wú)黃曲霉毒素殘留檢出。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，可能干擾測(cè)試結(jié)果，應(yīng)根據(jù)不同復(fù)方制劑的特點(diǎn)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，并進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)。GICA方法和 IAC-HPLC方法結(jié)果基本一致，表明這兩種方法在牛黃震驚丸黃曲霉毒素殘留檢測(cè)中結(jié)果具有可比性。