檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的研究進展

臺亞楠，董 曼，任婧楠，潘思軼，王可興，范 剛

檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的研究進展

臺亞楠，董 曼，任婧楠，潘思軼，王可興，范 剛*

（環(huán)境食品學教育部重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070）

檸檬烯是一種重要的功能性單萜，在食品中作為香精香料添加劑被廣泛使用，其含氧衍生物具更高經(jīng)濟價值。與傳統(tǒng)化學方法相比，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，區(qū)域和立體選擇性好，環(huán)境友好且獲得的為“天然”產(chǎn)品。本文介紹檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分析檸檬烯的主要轉(zhuǎn)化途徑以及轉(zhuǎn)化途徑中的關(guān)鍵酶，并系統(tǒng)地綜述影響生物轉(zhuǎn)化的因素。

檸檬烯；生物轉(zhuǎn)化；代謝途徑；酶

檸檬烯（limonene）又稱苧烯，學名為1-甲基-4（1-甲基乙烯基）環(huán)己烯，分子式C10H16（圖1），是除蒎烯外，最重要和分布最廣的萜烯，被發(fā)現(xiàn)存在于300多種植物中。在柑橘類水果（特別是其果皮）的精油中含量較高，在橙皮精油中的含量高達90%～95%[1]。

檸檬烯屬單環(huán)單萜，是一種無色至淡黃色液體，具有令人愉快的檸檬樣香氣，不溶于水，溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。檸檬烯有D和L兩種構(gòu)型，但主要以D-異構(gòu)體形式存在[2]。它們在外觀上沒有什么區(qū)別，都是無色至淡黃色液體，都有新鮮檸檬樣香氣，從不同的原料獲取的檸檬烯的氣味可能有差異，這是由其中的雜質(zhì)引起的[3]。檸檬烯是一種化學性質(zhì)非?；顫姷幕衔铮诠庹蘸涂諝饨佑|的條件下，檸檬烯可自動氧化成一系列的氧化單環(huán)單萜。

圖1 1 D-檸檬烯的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of D-limonene

微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細胞或酶對外源性底物進行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列酶對底物進行的催化反應(yīng)。與化學轉(zhuǎn)化相比，微生物轉(zhuǎn)化具有高度專一性、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、收率高、成本低及反應(yīng)步驟少等優(yōu)點，目前已被廣泛用于有機合成、新藥開發(fā)、體外代謝產(chǎn)物預(yù)測、香料生產(chǎn)等方面[4]。據(jù)報道，每年柑橘加工業(yè)會產(chǎn)生約36 000 t副產(chǎn)物D-檸檬烯，其價廉易得，是微生物轉(zhuǎn)化理想的起始物料[5]。

單萜類化合物是目前用得最多的香料。含氧單萜類有比萜烯更強的香味，但其在自然界中資源很少。用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)出來的香料化合物已被歐洲和美國食品法界定為“天然的”，而天然香料在價格上要比合成香料貴很多。因此，通過微生物轉(zhuǎn)化來制備單萜芳香產(chǎn)品，是新產(chǎn)品開發(fā)的新的思路和方法[6]。通過微生物的生物轉(zhuǎn)化，可以有效地將D-檸檬烯轉(zhuǎn)化為香氣更濃、應(yīng)用更為廣泛、商業(yè)價值更高的α-松油醇、紫蘇酸等物質(zhì)。

圖2 檸檬烯的6 種主要代謝途徑F ig.2 Six major metabolic pathways for limonene

1 檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

親脂性的單萜類化合物與微生物細胞膜磷脂疏水端有親合作用，對細胞產(chǎn)生毒性，而引起細胞膜的過氧化應(yīng)激反應(yīng)，結(jié)合在膜上的多種酶，其活性得到提高或者抑制，但部分氧化酶活性提高，導致產(chǎn)生豐富的氧化單萜。單萜的生物轉(zhuǎn)化是細胞為維持自身穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的一種動態(tài)調(diào)節(jié)。真菌、細菌、酵母以及微藻都可對檸檬烯進行生物轉(zhuǎn)化。在研究過的微生物菌株中，真菌為主，細菌次之，而酵母和微藻只有少量研究。

檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化主要產(chǎn)物有1、2位環(huán)氧化產(chǎn)物和其水解產(chǎn)物檸檬烯-1,2-二醇；3位羥基化產(chǎn)物異薄荷烯醇，羰基化產(chǎn)物異薄荷烯酮；6位羥基化產(chǎn)物香芹酮，羰基化產(chǎn)物香芹酮；7位甲基的羥基化產(chǎn)物紫蘇醇，進一步羰基化產(chǎn)物紫蘇酸；8位氧化產(chǎn)物松油醇；8,9位環(huán)氧化產(chǎn)物等[7]。紫蘇酸是一種無氣味的固體，對細菌和真菌具有強烈的抑制活性，可以作為天然防腐劑；其對惡性黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移具有抑制作用，與紫蘇醇聯(lián)合使用，可以作為非小細胞肺癌增殖的化學治療劑，具很高的藥用價值。香芹系列香料可用于酒類、糖果、軟飲料、烘烤食品加香用香精的調(diào)配，也是高級香精的重要原料。R-（+）-α-松油醇具有優(yōu)雅的紫丁香香氣，廣泛用于配制紫丁香型、柑橘型香精及香水中，亦可用于生產(chǎn)乙酸α-松油酯、二氫α-松油醇及其他合成香料。

2 檸檬烯的代謝途徑及代謝途徑中的關(guān)鍵酶

2.1 檸檬烯的代謝途徑

微生物對檸檬烯的代謝途徑主要有6種，見圖1，分別是：1）C7位氧化為紫蘇基化合物。2）1,2位雙鍵的環(huán)氧化和相應(yīng)二醇及其氧化產(chǎn)物的生成。3）C6位氧化生成香芹醇（carveol）、香芹酮（carvone）以及二氫香芹酮（dihydrocarvone）。4）C8位羥基化直接生成α-松油醇。5）C 3位羥基化生成異薄荷烯醇（isopiperitenol）和異薄荷烯酮（isopiperitenone）。6）8,9位環(huán)氧化生成檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物[8]。

Dhavalikar于1966年首次報道了檸檬烯的生物降解途徑，他們分離出一株以D-檸檬烯做唯一碳源和能源的Pseudomonas putida，從培養(yǎng)基中提取并分析，顯示產(chǎn)物有二氫香芹酮、香芹酮、香芹醇、檸檬烯-1,2-cis-二醇、檸檬烯-1,2-trans-二醇、檸檬烯-6,9-二醇、紫蘇酸、β-異丙烯基庚二酸、2-羥基-8-對-異丙基環(huán)己基甲酸和6,9-二羥基紫蘇酸。根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，他們認為該株假單胞菌Pseudomonas putida轉(zhuǎn)化檸檬烯的主要途徑是先對C7進行羥基化得到紫蘇醇，進一步氧化為紫蘇醛和紫蘇酸，然后發(fā)生類似β氧化的過程完全降解（途徑1）[8]。

Werf等[9]用D-檸檬烯做唯一碳源和能源，從120個菌株里面篩選出一株紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis DCL14。該菌株對檸檬烯存在一個完全不同的代謝途徑：首先引發(fā)檸檬烯1、2位C=C的環(huán)氧化得到檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物，然后水解為相應(yīng)二醇，接著被氧化為羥基酮，然后Baeyer-Villiger加氧酶催化（途徑2）。

O. pusilla通過烯丙基氧化，將（+）-檸檬烯轉(zhuǎn)化為trans-香芹醇和香芹酮（途徑3），通過內(nèi)環(huán)C=C雙鍵1,2位的環(huán)氧化轉(zhuǎn)化為trans-檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物（途徑2）。Ghasemi等[10]研究表明卵囊藻Oocystis pullisa生物轉(zhuǎn)化D-檸檬烯24 h后可以得到反式香芹醇，少量的香芹酮（途徑3）及反式檸檬烯氧化物。Rasoul-Amini等[11]對4 株微藻用海藻酸鹽固定化后發(fā)現(xiàn)其中3 株：Chlorella sp. MCCS030，Chlorella sp. MCCS031，Chlorella sp. MCCS031可以氧化檸檬烯的C6位得到cis-香芹醇、trans-香芹醇和香芹酮（途徑3）。其中Chlorella sp. MCCS 030可立體選擇性地將檸檬烯轉(zhuǎn)化為trans-香芹醇而不生成cis-香芹醇。

Adams等[12]報道指狀青霉Penicillium digitatum CMC可以將R-（+）-檸檬烯轉(zhuǎn)化為純R-（+）-α-松油醇（途徑4），8 h后產(chǎn)率達到93%。指狀青霉Penicillium digitatum DSM12840在檸檬烯濃度為14.7 mmol/L的麥芽酵母培養(yǎng)基上（pH 3.5）接種對數(shù)早期誘導孢子，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物R-（+）-α-松油醇最高濃度達到1 864 mg/L。Rottava等[13]用早前被其團隊分離的酵母菌株05.01.35、03.03.03、01.04.02和01.04.03轉(zhuǎn)化R-（+）-檸檬烯，先用0.1 g/100 mL的底物進行細胞誘導，通過中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計優(yōu)化后（底物質(zhì)量濃度1.75 g/100 mL，接種量2 g，底物與乙醇體積比1∶1）使得α-松油醇的產(chǎn)量達到1.74 g/L。Hormonema sp. UOFS Y-0067可以轉(zhuǎn)化D-檸檬烯并得到唯一產(chǎn)物trans-異薄荷烯醇（途徑5）[14]。

Werf等[15]用環(huán)己烷分離出1 株黃色桿菌Xanthobacter sp. C20，該菌株環(huán)氧化檸檬烯的8,9位生成唯一產(chǎn)物（4R,8R）-檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物（途徑6）。顯然，催化環(huán)己烷羥基化的單加氧酶并不能催化檸檬烯上的環(huán)己烯環(huán)，而是發(fā)生環(huán)氧化。

2.2 檸檬烯代謝途徑中的關(guān)鍵酶

2.2.1 P450單加氧酶

最初Abraham等[16]認為指狀青霉Penicillium digitatum DSM62840轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇的過程由水合酶催化，后來Tan等[17]發(fā)現(xiàn)加入鐵螯合劑鄰二氮雜菲和降低氧氣濃度，松油醇的產(chǎn)率下降，但氰化物并沒有抑制作用，表明不是水合酶而是P450加單氧酶在起作用：8,9位C=C環(huán)氧化，然后環(huán)氧化物“還原裂解”。環(huán)氧化反應(yīng)通常由P450依賴加單氧酶催化，檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物被認為是Penicillium digitatum生物轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇的一個中間物[15]。

Gloria等[18]報道P. digitatum DSM62840生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的酶是可誘導的，當用1.47 mmol/L（R）-（+）-limonene誘導后，松油醇的產(chǎn)量增加了14.58%。據(jù)報道[16]P. digitatum NRRL1202、枝孢菌Cladosporium和P. gladioli都有羥基化酶系的底物誘導效應(yīng)。指狀青霉的誘導系統(tǒng)可能和其他真菌和酵母的羥基化系統(tǒng)一樣為P450單加氧酶系。Maróstica等[19]用0.1%柑橘精油試圖誘導尖孢鐮刀菌152B的酶系，但152B相關(guān)酶沒有表現(xiàn)出可誘導性。

2.2.2 脫氫酶

Speelmans等[20]于1998年分離出一株惡臭假單胞菌Pseudomonas putida DSM 12264，該菌株能以D-檸檬烯做唯一的碳源和能源，得到（+）-紫蘇酸（酶活力為10U/g）。Eaton[21]報道P. putida F1對傘花烴降解是通過對異丙基苯甲酸途徑：單加氧酶先氧化甲基，然后在兩個脫氫酶作用下生成對枯茗酸。P.putina DSM12264和P.putida F1一樣，降解對傘花烴是通過對異丙基苯 甲酸途徑，并能 以對傘花烴為唯一碳源。檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇酸同樣涉及兩個脫氫酶氧化中間物紫蘇醇和紫蘇醛，當P. putida DSM 12264生長在含有檸檬烯或者對傘花烴的培養(yǎng)基上時，脫氫酶均被誘導，所以P. putida DSM12264轉(zhuǎn)化檸檬烯為紫蘇酸可能屬于對傘花烴的降解途徑。一株攜帶P. putida F1上轉(zhuǎn)化對傘花烴為對枯茗酸相關(guān)基因的大腸桿菌能將檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇酸，證實這一假設(shè)[20]。

2.2.3 水合酶

對烯烴非共軛雙鍵（與酮或者酯共軛的α,β不飽和系統(tǒng)的一部分）作用的水合酶很少。很少的微生物水合酶被分離出來，Cadwallader 等[22]1992年從Pseudomonas分離出的水合酶為一個跨膜蛋白。尖孢鐮刀菌152B轉(zhuǎn)化（R）-（+）-limonene為松油醇的酶為水合酶，不可誘導，胞內(nèi)酶且厭氧，轉(zhuǎn)化（S）-（-）-limonene的酶為檸檬烯-1,2-環(huán)氧化水解酶，不可誘導，胞內(nèi)酶且需氧，因為絕氧體系下沒有產(chǎn)物生成[23]。Chang等[24]報道Bacillus stearothermophilus BR388可將D-檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇醇、α-松油醇及香芹酮。攜帶該菌株9.6 kb染色體片段的大腸桿菌能以檸檬烯為唯一碳源，并生成相同的產(chǎn)物。隨后研究發(fā)現(xiàn)3.6 kb的亞片段可以編碼一個檸檬烯羥化酶，該酶在檸檬烯的6和7位作用生成紫蘇醇和香芹酮（由香芹醇通過受體菌的非特異性脫氫酶得到）的混合物。與攜帶9.6 kb的菌株相比，產(chǎn)物中并沒有α-松油醇，表明松油醇生成的相關(guān)酶是在9.6 kb染色體片段中除了3.6 kb這一亞片段中的其他片段編碼[25]。

2.2.4 環(huán)氧化物水解酶

Carla等[26]發(fā)現(xiàn)Rhodococcus erythropolis DCL14 環(huán)氧化物水解酶不屬于α/β折疊水解酶家族，該酶具有高的對映體選擇性，只有cis-檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物被轉(zhuǎn)化為檸檬烯-1,2-二醇，而trans-檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物不被轉(zhuǎn)化。

3 影響檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的因素及優(yōu)化

3.1 底物

3.1.1 底物毒性

親脂性單萜，對微生物細胞來說，有一定毒性，它能夠引起過氧化應(yīng)激反應(yīng)。細胞膜上的磷脂在氧自由基的作用下，會發(fā)生降解反應(yīng)，引起膜磷脂層的結(jié)構(gòu)改變，滲透性、運輸能力和流動性都受到影響，這些變化能進一步影響到一些結(jié)合在膜 上的酶的活性，嚴重的甚至可使細胞膜功能喪失。Gloria等[18]發(fā)現(xiàn)不同的檸檬烯濃度會影響Penicilliun digitatum生物轉(zhuǎn)化的選擇性及效率，檸檬烯濃度在10～15 mmol/L之間，產(chǎn)物為（R）-（+）-α-松油醇；濃度繼續(xù)升高（＞30 mmol/L）會生成其他氧化產(chǎn)物如cis/trans香芹醇、香芹酮、檸檬烯-1,2-二醇、苯乙醇、β-蒎烯、檜萜和冬青油烯及兩種不確定化合物；檸檬烯濃度為15 mmol/L時，生物轉(zhuǎn)化率最高為75.21%，但當濃度從30～100 mmol/L增加時，生物轉(zhuǎn)化的效率下降。小被孢霉Mortierella minutissima生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的主要 產(chǎn)物為紫蘇醛和紫蘇醇，當檸檬烯體積分數(shù)為0.5%，紫蘇醇產(chǎn)量209.5 mg/L，此后若繼續(xù)增加底物濃度，產(chǎn)量會下降[27]。Adams等[12]報道在底物總添加量一定的情況下，分批多次加樣可以減小檸檬烯對微生物細胞的毒性。

Penicillium digitatum DSM62840可以區(qū)域選擇性轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯為α-松油醇，但是當檸檬烯的初始濃度超過1.9 mmol/L時，即出現(xiàn)明顯的生長抑制。研究表明，15 mmol/L的檸檬烯可以使9 0%以上的真菌致死。采用封閉氣體循環(huán)生物反應(yīng)器，193 h后α-松油醇的產(chǎn)量可達1 009 mg/L，平均生產(chǎn)力8～9 mg/（L·h），為傳統(tǒng)搖床培養(yǎng)的8 倍。與開放的生物反應(yīng)器相比，該生物轉(zhuǎn)化過程分為兩步：真菌先在傳統(tǒng)開放廢氣生物反應(yīng)器中生長至穩(wěn)定期，再開始封閉氣體循環(huán)，通過氣相連續(xù)補充合適劑量的檸檬烯可有效防止底物的毒害作用[28]。

3.1.2 底物低溶解性

萜類在水相中溶解性低，化學穩(wěn)定性差易發(fā)生自動氧化[15]。檸檬烯在水中的溶解度很低（0.015 mmol/L），為增加檸檬烯的溶解度可采用共溶劑。但很多有機溶劑對微生物有毒害作用，可用lgP值來表示其毒性大小，lgP值在1～5之間的有機溶劑具有強毒性。Adams等[12]比較在指狀青霉轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇的過程中，不同共溶劑（不同lgP值：甲醇0.77、乙醇0.31和丙酮0.24）及體積分數(shù)（0.6%、0.9%、1.4%）的影響時發(fā)現(xiàn)，乙醇作為共溶劑且在體積分數(shù)為0.6%時產(chǎn)率略高，8 h后產(chǎn)率可達93%。Tan等[17]發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)2%時，即對P. digitatum生物轉(zhuǎn)化（R）-（+）-檸檬烯為（R）-（+）-α-松油醇有抑制作用。目前研究表明甲醇、乙醇、丙酮體積分數(shù)在0.5%～1.5%之間有利于生物轉(zhuǎn)化。Trytek等[27]報道使用0.3%的甲醇作為共溶劑，小被孢霉Mortierella minutissima生物轉(zhuǎn)化檸檬烯主要產(chǎn)物紫蘇醛和紫蘇醇的產(chǎn)量增加1.25 倍，當甲醇體積分數(shù)大于25%時，就無產(chǎn)物生成；加入十二烷和十六烷后只有痕量紫蘇醇生成，但紫蘇醛的產(chǎn)量卻增加。

3.1.3 共底物

Bicas等[29]運用響應(yīng)面法優(yōu)化了用尖孢鐮刀菌生物轉(zhuǎn)化D-檸檬烯為R-（+）-α-松油醇的條件，優(yōu)化后產(chǎn)量達到2.4 g/L，為之前報道的6倍多。他們首次嘗試利用生物表面活性劑Bacillus subtilis作為共底物，生物表面活性劑可以降低界面張力，增加微生物對疏水性底物的利用。遺憾的是Plackett-Burman篩選設(shè)計表示該生物表面活性劑對生物轉(zhuǎn)化并無統(tǒng)計效應(yīng)。

3.2 產(chǎn)物

3.2.1 產(chǎn)物的抑制作用

產(chǎn)物會抑制微生物的生長和生物轉(zhuǎn)化。Pseudomonas putida DSM 12264的最大生長速率隨紫蘇酸的濃度增加線性降低，當紫蘇酸濃度為（165±7）mmol/L時，菌體生長完全抑制；紫蘇酸濃度很低（2 mmol/L）即抑制該生物轉(zhuǎn)化，當紫蘇酸濃度＞25 mmol/L時，靜息細胞轉(zhuǎn)化檸檬烯為紫蘇酸的酶活從沒有紫蘇酸時的8 U/g細胞干質(zhì)量下降為＜0.5 U/g細胞干質(zhì)量。為降低產(chǎn)物的抑制作用Mirata將 ISPR與饋料式生物反應(yīng)器相結(jié)合，用陰離子交換樹脂Amberlite IRA 410 Cl進行ISPR，選用饋料式生物反應(yīng)器，連接一個Amberlite IRA 410 Cl組成的流化床組成一個外循環(huán)管路，通過連續(xù)循環(huán)未過濾的液體培養(yǎng)基，使產(chǎn)物去除，降低產(chǎn)物抑制。7 d后紫蘇酸累積濃度達到187 mmol/L（31 g/L），是目前微生物氧化單萜的最高產(chǎn)量[30]。

3.2.2 產(chǎn)物不同萃取方法

Maróstica等[19]在用Fusarium oxysporum生物轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇的過程中，用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）進行萃取，培養(yǎng)72 h后產(chǎn)量為2.4 g/L，但Bicas采用相同實驗條件用乙酸乙酯萃取后產(chǎn)量達到4 g/L[29]。

3.3 培養(yǎng)條件

3.3.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基對生物轉(zhuǎn)化的選擇性和產(chǎn)物質(zhì)量濃度有很大影響[17]。Gloria等[18]研究YMPG（酵母提取物5 g/L、麥芽浸粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、細菌蛋白胨5 g/L）、MYB（酵母提取物3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、葡萄糖 10 g/L、細菌蛋白胨10 g/L）和YG（酵母提取物3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、細菌蛋白胨1 g/L）培養(yǎng)基對Penicillium digitatum DSM62840生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的影響發(fā)現(xiàn)，在MYB和YG培養(yǎng)基上，檸檬烯被轉(zhuǎn)化為（R）-（+）-α-松油醇，該轉(zhuǎn)化有高度的對映選擇性（enantioselective）：（R）-（+）-檸檬烯被轉(zhuǎn)化為純（R）-（+）-α-松油醇（對映體過量百分數(shù)＞99%），而（S）-（-）-檸檬烯轉(zhuǎn)化量很小。轉(zhuǎn)化48 h后，MYB培養(yǎng)基松油醇的質(zhì)量濃度為（1 585±19）mg/L，是YG培養(yǎng)基的3 倍；而在YMPG培養(yǎng)基上96 h后檸檬烯則轉(zhuǎn)化為trans-香芹醇。YG培養(yǎng)基的低生物轉(zhuǎn)化率可能是因為其葡萄糖含量過高，降低了微生物使用檸檬烯作為碳源和能源的機會。

Adams等[12]比較MEB和MYB培養(yǎng)基對3株P(guān)enicillium digitatum菌株CLE、CMC和PDD生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的影響，發(fā)現(xiàn)MYB培養(yǎng)基松油醇產(chǎn)量（63.3±2.3）%高于MEB（46.7±0.1）%。

Badee等[31]發(fā)現(xiàn)Penicillium digitatum（NRRL1202）可將橘皮精油轉(zhuǎn)化為α-松油醇，MYB培養(yǎng)基（酵母提取物3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、葡萄糖10 g/L、細菌蛋白胨10 g/L，pH 6.1）生物轉(zhuǎn)化率高于MEB培養(yǎng)基（麥芽浸粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、細菌蛋白胨1 g/L，pH 5.4），可能是因為MEB低的pH值影響了生物轉(zhuǎn)化；Bowen[32]報道添加多余的葡萄糖會降低檸檬烯轉(zhuǎn)化為松油醇的產(chǎn)量，MEB的高葡萄糖含量可能也影響了其生物轉(zhuǎn)化。

木薯廢液由于其高有機質(zhì)含量，且含有氰化物，被認為“有害”。Maróstica等[19]用農(nóng)業(yè)殘留物木薯渣液做培養(yǎng)基，研究3 種菌株P(guān)enicillium sp. 2025，Aspergillus sp. 2038和Fusarium oxysporum 152B對柑橘精油（orange essential oil，OEO）的生物轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)木薯廢液培養(yǎng)基上菌絲生長良好，菌株先在木薯培養(yǎng)基CM（cassava medium）上生長，然后將菌絲移到另一個以柑橘精油為唯一碳源和能源（sole carbon resource，SCS）的礦質(zhì)培養(yǎng)基MM上，所得松油醇的產(chǎn)量最高。3 d后，F(xiàn)usarium oxysporum 152B產(chǎn)松油醇達450 mg/L，與只在木薯培養(yǎng)基CM上培養(yǎng)提高了2 倍。

3.3.2 接種物

Bicas等[33]用Fusarium oxysporum生物轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇時，將接種物分別凍融和凍干。發(fā)現(xiàn)凍融后生物轉(zhuǎn)化速率加快，凍干后松油醇產(chǎn)量減少40%（酶被破壞）。使用傳統(tǒng)方法（新鮮生物質(zhì)）和凍融（速率加快）松油醇最大產(chǎn)量都能達到4 g/L，此后繼續(xù)添加底物檸檬烯產(chǎn)物也不增加，可見這并不是因為酶活降低，而要改進培養(yǎng)基或使用兩相系統(tǒng)來增加產(chǎn)量。

Tan等[34]用海藻酸鈣水凝膠固定化指狀青霉Penicillium digitatum菌絲，使得α-松油醇產(chǎn)量達到12.83 mg/（g·d）。

Gloria等[18]報道當檸檬烯在Penicillium digitatum DSM 62840的對數(shù)早期（72 h）加入時，松油醇的產(chǎn)量最高為1 667 mg/L，其他時期加入則產(chǎn)量會下降50%～60%。

3.3.3 pH值

Gloria等[18]報道在pH值為3.0和3.5時，Penicillium digitatum DSM62840特異性生產(chǎn)松油醇，當pH 3.5時，松油醇產(chǎn)量最高為（1 537±34）mg/L；當pH＞3.5時，由于分子內(nèi)重排產(chǎn)生檸檬烯其他的氧化產(chǎn)物。他還首次發(fā)現(xiàn)在pH值為4.5和6.0時，檸檬烯的氧化產(chǎn)物出現(xiàn)了沉香醇（linalool）和正/反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇（cis/ trans-p-menth-2,8-dien-1-ol），可能是因為弱酸性環(huán)境使Penicillium digitatum DSM62840細胞產(chǎn)生了一個新的代謝檸檬烯的途徑。

3.3.4 時間

小被孢霉Mortierella minutissima生物轉(zhuǎn)化檸檬烯產(chǎn)物紫蘇醇在24～48 h內(nèi)大量積累[27]，Tan等[17]報道指狀青霉轉(zhuǎn)化檸檬烯為松油醇的過程中也有類似現(xiàn)象，但Pseudomonas putida在120 h才有大量產(chǎn)物積累[27]。Gloria等[18]報道指狀青霉Penicillium digitatum DSM62840在最初的24 h積累松油醇，48 h后松油醇的產(chǎn)量即保持不變。Tan等[17]報道指狀青霉Penicillium digitatum NRRL1202在pH 5.4的MYB培養(yǎng)基中，生物轉(zhuǎn)化只在對數(shù)早期和中期之間進行。Jan等[35]報道指狀青霉8 h即可將檸檬烯轉(zhuǎn)化為α-松油醇，而莖枯菌Corynespora cassiicola 5 d后才可將R-（+）-檸檬烯轉(zhuǎn)化為（1S,2S,4R）-檸檬烯-1,2-二醇[36]。

3.3.5 溶氧量

液相中的溶解氧顯著影響細菌和真菌對于萜類的生物轉(zhuǎn)化。傳統(tǒng)的攪拌通氧，因為氧氣溶解性低以及汽液傳質(zhì)阻力高使得氧供應(yīng)不足。Trytek等[27]報道在小被孢霉Mortierella minutissima生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的過程中，加入H2O2到生物反應(yīng)器中，與傳統(tǒng)的磁力攪拌通氧相比，主要產(chǎn)物紫蘇醇48 h后達到105 mg/L，比普通攪拌同樣增產(chǎn)2 倍多。但H2O2的濃度增大產(chǎn)量會下降，選擇1%為佳。

4 結(jié) 語

面對全球人口健康、資源緊缺、環(huán)境污染、糧食危機等問題，從天然植物中提取和化學合成香料已經(jīng)不能滿足社會發(fā)展和消費者的需求。生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香料以其效率高、反應(yīng)溫和及無污染等優(yōu)點日益成為研究的熱點。利用廉價而有效的原料來生物轉(zhuǎn)化合成天然香料是最有前途的發(fā)展方向[28]。

目前，國內(nèi)外研究學者已經(jīng)進行了較多的生物轉(zhuǎn)化法合成天然香料的研究，然而，有關(guān)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、定向轉(zhuǎn)化機制及調(diào)控方面的研究卻鮮有報道。對于微生物轉(zhuǎn)化檸檬烯過程的關(guān)鍵酶基因的分離、克隆、表達和調(diào)控已成為研究熱點。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因工程，可望實現(xiàn)有用目標化合物的工業(yè)化高效生產(chǎn)。此外，分離純化的酶制劑在有機合成化學中也具有重要的應(yīng)用前景。

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Recent Advances in Biotransformation of Limonene

TAI Ya-nan, DONG Man, REN Jing-nan, PAN Si-yi, WANG Ke-xing, FAN Gang*
(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Limonene is one of the most widely distributed terpenes in nature, and is widely used as a flavor and fragrance additive in food products. The biotransformation of limonene to more valuable oxygenated derivatives has emerged as an attractive alternative. The reaction proceeds under mild conditions without generating toxic wastes, and the products obtained with better regio-and enantioselectivity can be labeled as “natural”. Biotransformation products of limonene are described in this paper. Meanwhile, the major biotransformation pathways and some enzymes involved are elucidated. Furthermore, this paper provides a systematic review of the factors affecting the biotransformation of limonene.

limonene; biotransformation; metabolic pathway; enzyme

TS255.1

A

1002-6630（2014）17-0272-06

10.7506/spkx1002-6630-201417052

2013-07-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101239）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2013PY097）；湖北省研究與開發(fā)計劃項目（2011BBB045）

臺亞楠（1990—），女，碩士研究生，研究方向為風味化學。E-mail：824364166@qq.com

*通信作者：范剛（1982—），男，副教授，博士，研究方向為風味化學。E-mail：fangang@mail.hzau.edu.cn