白菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)研究

劉 永，姜 冰，吳 巖，魏東旭，曾繁華，閻秀峰

白菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)研究

劉 永1,2，姜 冰2，吳 巖2，魏東旭2，曾繁華3，閻秀峰1,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；3.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116600）

培養(yǎng)8 葉期無菌白菜幼苗，添加5 種二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥（馬拉硫磷、樂果、甲拌磷、乙拌磷及特丁硫磷），用氣相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測二硫代磷酸酯類農(nóng)藥及O,O-二甲基二硫代磷酸酯殘留量。結(jié)果表明：二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的含量在實(shí)驗(yàn)過程中呈減少的趨勢，農(nóng)藥在樣本培養(yǎng)過程被逐漸降解，10 d內(nèi)降解水平為13.4%～65.0%，無菌苗添加藥物組降解速率明顯低于正常培養(yǎng)添加藥物對照組。使用一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對農(nóng)藥代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評價(jià)，無菌條件下馬拉硫磷降解速率最快，降解速率常數(shù)為0.034 67，降解半衰期為19.9 d，特丁硫磷降解速率常數(shù)最小，降解速率常數(shù)為0.007 17，降解半衰期為96.7 d，樂果、甲拌磷及乙拌磷相對穩(wěn)定，但降解動(dòng)力學(xué)差別較大。

白菜；有機(jī)磷農(nóng)藥；降解動(dòng)力學(xué)

有機(jī)磷農(nóng)藥具有廣譜、高效等眾多優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前農(nóng)藥的三大支柱之一，經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的不斷發(fā)展，不論品種數(shù)量、產(chǎn)量規(guī)模等都位居各種農(nóng)藥首位[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)的廣泛應(yīng)用可能污染土壤、地表水及生物等，并最終傳遞于食品[2-5]。二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常用一類農(nóng)藥，多數(shù)毒性較強(qiáng)，殺蟲效果好，降解周期長。主要種類有馬拉硫磷、甲拌磷、乙拌磷、特丁硫磷及樂果等（圖1），其主要中間體及代謝產(chǎn)物為O,O-二甲基二硫代磷酸酯或O,O-二乙基二硫代磷酸酯，也可以降解為其他小分子化合物[6-9]，蔬菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝物在日常的例行監(jiān)測中常有檢出。

圖1 二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of dithio organophosphorus pesticides

二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的降解主要是通過在光照、水分及溫度等條件下的水解作用[10-13]、微生物及其他生物體的生物降解等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)考慮到自然條件下微生物的影響，以無菌白菜（Brassica rapa pekinensis）為生物模型，施藥后用氣相色譜及液相色譜-質(zhì)譜方法檢測二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的變化。通過監(jiān)測藥物的代謝過程，根據(jù)農(nóng)藥降解規(guī)律，用一級動(dòng)力學(xué)生物降解模型，研究二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的降解過程及降解動(dòng)力學(xué)，為有機(jī)磷農(nóng)藥的生物學(xué)降解提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，探求蔬菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的降解動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白菜種子 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。

有機(jī)磷農(nóng)藥及代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品：馬拉硫磷（99.5%）、甲拌磷（99.5%）、乙拌磷（99.5%）、特丁硫磷（99.6%） 瑞士Fluka公司；樂果（99.8%） 美國Sigma公司；O,O-二甲基二硫代磷酸酯（97%） 中國維賽諾化學(xué)技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮溶解，4 ℃冰箱保存，使用時(shí)用丙酮稀釋至所需質(zhì)量濃度；丙酮為色譜純試劑；乙酸乙酯為分析純試劑；500 mg 6 mL活性碳固相萃取柱小柱 美國Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890 N型氣相色譜儀（配火焰光度檢測器和磷濾光片） 美國Agilent公司；UPLC-XEVO TQ液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電噴霧離子源） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 無菌白菜幼苗培養(yǎng)及處理

白菜種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡30 s，無菌水洗3 次后在無菌、25 ℃條件下靜置24 h，將種子點(diǎn)播于裝有約15 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%），37 ℃高溫催芽48 h，挑出無菌芽苗，移植2 000 mL三角瓶內(nèi)，按30 ℃光照期/25 ℃黑暗期培養(yǎng)，每隔3 d更換一次營養(yǎng)液，并對培養(yǎng)液進(jìn)行菌檢。

以8 葉期白菜幼苗為研究對象，將無菌白菜的培養(yǎng)基添加農(nóng)藥并進(jìn)行更換，添加量為10.0 mg/kg，24 h后將10 組樣本（每組15 株，每株在250 mL三角瓶中單獨(dú)培養(yǎng)）移植至新培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，不再更換培養(yǎng)基（對照組取培養(yǎng)基相同量土壤，并加入等量水），同時(shí)檢測樣本及對照組農(nóng)藥含量，之后每48 h進(jìn)行一次取樣檢測，分別對培養(yǎng)0、2、4、6、8、10 d白菜進(jìn)行檢測。

1.3.2 前處理

取一株樣本，稱取后（精確到0.01 g）用剪刀進(jìn)行破碎，置于150 mL小燒杯中，加入40 mL乙酸乙酯，均質(zhì)器均質(zhì)2 min（不低于10 000 r/min），然后用50 mL離心管4 000 r/min離心5 min，取20 mL上層清液，過500 mg 6 mL活性碳（小柱經(jīng)5 mL乙酸乙酯活化處理），再用10 mL乙酸乙酯洗脫小柱，流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用丙酮定容待測定；液相色譜-質(zhì)譜檢測用乙腈-5 mmol/L乙酸氨（3∶7，V/V）定容。

1.3.3 氣相色譜條件

Agilent 7890氣相色譜儀，配火焰光度檢測器；毛細(xì)管氣相色譜柱：DB-1701（30 m×0.250 mm，0.25 μm）；程序升溫：100 ℃ 1 min→10 ℃/min→210 ℃10 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：高純氮?dú)?；進(jìn)樣量：1.0 μL。采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量計(jì)算。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜為Waters ACQUITY Ultra Performance液相色譜系統(tǒng)，并配有溶劑管理器，液相色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH HILIC（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相：乙腈-5 mmol/L乙酸氨（30∶70，V/V），流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣器用強(qiáng)溶劑（30%乙腈）和弱溶劑（70%乙腈）清洗。

Waters XEVO TQ三重四極質(zhì)譜儀，并配有電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)模式，檢測條件為：毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣N2（650 L/h）；霧簾氣N2（50 L/h）；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐空電壓30 V；子離子的碰撞能量分別為20 eV和15 eV；駐留時(shí)間：50 ms，母離子：m/z 157.0，子離子為m/z 111.9 和m/z 141.9，其中為定量離子m/z 141.9；使用MassLynx v 4.1系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的降解

有機(jī)磷農(nóng)藥一般采用氣相色譜-火焰光度法進(jìn)行檢測，前處理方法多采用乙酸乙酯、二氯甲烷等極性較強(qiáng)的有機(jī)試劑提取[16-17]，并根據(jù)基質(zhì)的情況采用不同的凈化方式。本研究所使用的二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測方法與以上方法基本一致，5 種有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方法的回收率為85.8%～108.7%，精密度范圍為2.13%～5.25%，檢出限范圍為0.005～0.01 mg/kg，在0.0 1～1.0 0 m g/k g范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.998 9～0.999 7，典型色譜圖如圖2，分離及凈化效果較好。

圖2 二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（a）及樣本（b）氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of dithio organophosphorus pesticide standards (a) and samples (b)

白菜樣本添加二硫代磷酸酯類農(nóng)藥，10 d內(nèi)長勢與對照組無明顯差異，樣本與培養(yǎng)基總質(zhì)量差異不大，均在75.28～80.86 g之間（對照組包括土壤），實(shí)驗(yàn)組與對照組之間最大差異為1.87 g，無規(guī)律分布。樣本在0～10 d內(nèi)，除0 d樣本只檢測白菜樣本，其余每隔2 d將樣本及培養(yǎng)基進(jìn)行提取和凈化，用氣相色譜法進(jìn)行檢測。由表1可知，樣本中二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的含量呈減少的趨勢，農(nóng)藥在樣本培養(yǎng)過程被逐漸降解，10 d內(nèi)降解水平為13.4%～65.0%（相對0 d時(shí)的農(nóng)藥殘留量），降解趨勢與Uygun[18]、Zhao Xinhuai[19]等研究結(jié)果一致。

表1 白菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥不同時(shí)間的殘留含量x±s,, n=5）Table 1 Residual concentrations of dithio organophosphorus pesticides in Chinese cabbage at different culture time (x±s,, n= 5)

Kralj等[20]研究表明，光照條件下能使有機(jī)磷降解，降解常數(shù)與光強(qiáng)度有關(guān)；李順鵬等[21]將甲基對硫磷的降解菌Alcaligenes sp.接種于含有甲基對硫磷的土壤中，表現(xiàn)了較強(qiáng)的降解農(nóng)藥殘留的生態(tài)效應(yīng)，稻米與稻殼中甲基對硫磷比對照下降了82.2%～100%，田間實(shí)驗(yàn)中，稻米中的甲基對硫磷含量為0.065 mg/kg；Uygun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小麥在室溫下存儲5 個(gè)月，4 種有機(jī)磷降解了76%～88%[18]。本實(shí)驗(yàn)中5 種二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的降解過程及規(guī)律與以上文獻(xiàn)大致相同，雖然實(shí)驗(yàn)中在無菌條件下進(jìn)行，但培養(yǎng)基的水分含量高，促進(jìn)了農(nóng)藥的降解。

2.2 二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的降解動(dòng)力學(xué)

二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的降解是一種拐點(diǎn)的降解曲線，符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模式[22-23]，根據(jù)一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，有機(jī)磷農(nóng)藥的降解速率常數(shù)和半衰期可以從表2的數(shù)據(jù)計(jì)算得出。

表2 白菜中二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)Table 2 Degradation kinetics of dithio organophosphorus pesticides in Chinese cabbage

由表2可知，二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥在無菌白菜中的降解與對照組差異較為明顯，除2 d時(shí)對照組有機(jī)磷農(nóng)藥降解差異較小外，其余均明顯快于對照組，說明微生物在降解過程中起到比較重要的作用。各組實(shí)驗(yàn)包括土培對照組中，馬拉硫磷降解速率最快，降解速率常數(shù)為0.034 67，降解半衰期為19.9 d；特丁硫磷降解速率常數(shù)最小，降解速率常數(shù)為0.007 17，降解半衰期為96.7 d，這個(gè)可能與馬拉硫磷的結(jié)構(gòu)與特性有關(guān)。5 種二硫代磷酸酯農(nóng)藥中，馬拉硫磷和樂果磷酸酯結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)甲基，其余3 種有機(jī)磷農(nóng)藥均為乙基，由于甲基烷氧基結(jié)構(gòu)的推電子作用小于乙基烷氧基，從而降低了磷原子的親和性，一般情況下甲基磷酸酯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比乙基磷酸酯差，更有利于水解效應(yīng)或生物體中有機(jī)磷水解酶對其的攻擊[10,24]；又由于馬拉硫磷S—C結(jié)構(gòu)中，碳原子為一個(gè)手性原子，報(bào)道稱這種結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷農(nóng)藥毒性較低[10]，可能有利生物體的利用和吸收。樂果降解速率較快，除了甲基烷氧基結(jié)構(gòu)外，其中含有的胺甲基結(jié)構(gòu)，更容易形成去甲基化樂果，從而加快了其降解速率。

Zhao Xinhuai等[19]研究牛奶中7 種有機(jī)磷農(nóng)藥在微生物作用下的降解，Uygun等[18]也研究小麥存儲過程中有機(jī)磷農(nóng)藥的降解，都表明馬拉硫磷的穩(wěn)定性較差，降解速率最快，其他有機(jī)磷農(nóng)藥的降解與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

2.3 代謝產(chǎn)物含量分析

圖3 3 O,O-O-二甲基二硫代磷酸酯液相色譜-質(zhì)譜-Fig.3 Mass spectrum of O,O-dimethyl phosphorodithioate

二硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥被生物體酶解、水解、甚至被氧化的過程，馬拉硫磷和樂果主要代謝物為O,O-二甲基二硫代磷酸酯，甲拌磷、乙拌磷和特丁硫磷主要代謝產(chǎn)物為O,O-二乙基二硫代磷酸酯，其他物質(zhì)如氧化生成硫趕硫酸酯、硫逐磷酸酯類及其他小分子化合物[7]，其含量都較低。由于馬拉硫磷代謝較快，實(shí)驗(yàn)對馬拉硫磷實(shí)驗(yàn)組中O,O-二甲基二硫代磷酸酯的含量進(jìn)行了檢測。代謝物采用與氣相色譜法相同的前處理方式，液相色譜柱選擇親水相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）柱，以增強(qiáng)極性化合保留，獲得較好的分離效果；代謝物的檢測方法的回收率為71.4%～98.3%，精密度為7.30%，檢出限為0.01 mg/kg，在0.01～1.00 mg/kg范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.998 2，分析方法滿足檢測要求，典型質(zhì)譜圖如圖3。

圖4 馬拉硫磷實(shí)驗(yàn)組O,O-二甲基二硫代磷酸酯含量變化Fig.4 Change in O,O-dimethyl phosphorodithioate content in Chinese cabbage cultured in the presence of malathion

由圖4可知，對降解速率較快的馬拉硫磷實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行代謝物檢測，O,O-二甲基二硫代磷酸酯含量是一個(gè)迅速增加，并逐漸恒定的過程，這可能與O,O-二甲基二硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)，生物降解和水解生成的O,O-二甲基二硫代磷酸酯，又被生物體酶解或水解。

3 結(jié) 論

培養(yǎng)8 葉期無菌白菜幼苗，添加10.0 mg/kg馬拉硫磷、樂果、甲拌磷、乙拌磷及特丁硫磷，樣本中二硫代磷酸酯類農(nóng)藥的含量逐漸降解，10 d時(shí)降解水平為13.4%～65.0%。使用一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對農(nóng)藥代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評價(jià)，無菌條件下馬拉硫磷降解速率最快，特丁硫磷降解速率常數(shù)最小，樂果、甲拌磷及乙拌磷相對穩(wěn)定，但降解動(dòng)力學(xué)差別較大。

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Degradation Kinetics of Dithio Organophosphorus Pesticides in Cabbage

LIU Yong1,2, JIANG Bing2, WU Yan2, WEI Dong-xu2, ZENG Fan-hua3, YAN Xiu-feng1,*
(1. Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Technology Center of Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 3. Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116600, China)

Seedlings of eight-leafed Chinese cabbage (Brassica rapa pekinensis) were cultured in germ-free conditions supplemented with five dithiophosphate organophosphorus pesticides including malathion, dimethoate, phorate, disulfoton and terbufos. The residues of the organophosphorus pesticides and O,O-dimethyl phosphorodithioate in the seedlings of Chinese cabbage were determined by gas chromatography-liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS). As the culture period progressed, the contents of all these dithiophosphate pesticides decreased and were degraded by 13.4%-65.0% in 10 days. The dithiophosphate pesticides in Chinese cabbage seedlings were degraded significantly slower under germfree culture conditions than under normal culture conditions. The metabolic kinetics of the pesticides followed a first-order kinetic model. Under sterile conditions, malathion was degraded fastest with a rate constant of 0.034 67 and a half life of 19.9 d, Terbufos showed the smallest degradation rate constant of 0.007 17, and the degradation half life was 96.7 days. Dimethoate, phorate and disulfoton were more stable, but the degradation kinetic parameters considerably varied among them.

Brassica rapa pekinensis; dithio organophosphorus pesticides; degradation kinetics

TS201.6

A

1002-6630（2014）17-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201417019

2013-10-23

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009IK177）

劉永（1976—），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：liuyciq@163.com

*通信作者：閻秀峰（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail：xfyan@nefu.edu.cn