綿羊可食性組織中鹽酸克倫特羅殘留規(guī)律的研究

■劉 萌蘇曉鷗張 瑜 王國(guó)春

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京100081；2.遼寧省朝陽市朝牧種畜場(chǎng)，遼寧朝陽122000)

鹽酸克倫特羅 (Clenbuterol hydrochloride，CL)是一種人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑。由于鹽酸克倫特羅可減少脂肪沉積、增加肌肉生成，曾經(jīng)被用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑在動(dòng)物生產(chǎn)上使用。但是鹽酸克倫特羅可能會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)形成積累性殘留，人食用含有鹽酸克倫特羅殘留的動(dòng)物性食品后，會(huì)出現(xiàn)急性中毒癥狀，如過敏、惡心、嘔吐、心率失常、高血壓等。豬(Smith，2000)、牛（Girault，1990）、馬（Hagedorn，1995）、雞（Malucelli，1994）等動(dòng)物體內(nèi)鹽酸克倫特羅代謝殘留已有研究，在養(yǎng)羊生產(chǎn)上使用鹽酸克倫特羅是繼豬、牛、馬、雞后的又一違法現(xiàn)象，而相比于豬、牛、馬、雞，關(guān)于鹽酸克倫特羅在羊體內(nèi)的殘留消除規(guī)律的研究較少。本研究以綿羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，探究鹽酸克倫特羅在綿羊可食性組織中的殘留規(guī)律，進(jìn)行深入分析與總結(jié)，探討鹽酸克倫特羅在綿羊體內(nèi)的蓄積性，探究監(jiān)測(cè)鹽酸克倫特羅非法使用的理想靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

21只平均體重為（30±5）kg的健康雄性小尾寒羊（遼寧省朝陽市朝牧種畜場(chǎng)提供），飼料為無任何藥物的全混合日糧。預(yù)飼2 d，自由采食及飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以每天15 μg/kg體重的劑量的鹽酸克倫特羅對(duì)21只綿羊連續(xù)灌胃給藥21 d，在最后一次給藥后停止給藥21 d。

1.3 樣品采集

在給藥第7、14、21 d（停藥0 d）及停藥第3、7、14、21 d時(shí)，隨機(jī)屠宰3只綿羊，采集肝臟、肺臟、腎臟、心臟、肌肉樣品，迅速置于編號(hào)的密封袋中，-20℃保存。

1.4 樣品處理及測(cè)定

取冷凍樣品，在常溫下解凍。分別取各組織2 g于50 ml離心管中，加入6 ml pH值5.2的乙酸銨溶液與100 μl 10 μg/l鹽酸克倫特羅D9內(nèi)標(biāo)溶液（WITEGA公司），用可調(diào)高速分散器進(jìn)行勻漿，加入30 μl β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，在55℃條件下的恒溫培養(yǎng)振蕩器中酶解2 h，在酶解后的組織中加入1 ml 30%高氯酸溶液，渦旋混合30 s，沉淀蛋白，8 000 r/min離心10 min，取上清液備用；將混合型陽離子交換柱(PCX)置于固相萃取裝置上，依次用3 ml甲醇活化，3 ml水平衡，將上述上清液過柱，控制過柱速度在1 ml/min，依次用3 ml水、3 ml甲醇淋洗，用3 ml 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50℃氮?dú)獯蹈?，? ml液相初始溶液（0.1%甲酸水溶液∶乙腈，9∶1）復(fù)溶，充分振蕩溶解，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)分析。分析方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22286-2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》，在此標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 數(shù)據(jù)處理

分析儀器控制、數(shù)據(jù)采集通過軟件Masslynx 4.1進(jìn)行。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理，運(yùn)用SAS 9.2軟件進(jìn)行方差分析，并使用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸克倫特羅在組織中的殘留分析

不同采樣時(shí)間點(diǎn)各個(gè)組織中鹽酸克倫特羅殘留濃度見表1。由表1可知，在綿羊主要可食性組織中，肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度最高，且顯著高于其他組織(P＜0.05)，在給藥第7 d時(shí)，肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度達(dá)到了95.94 ng/g，是其他幾種組織在同一采樣時(shí)間點(diǎn)的3～9倍；在給藥第14 d時(shí)，肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度達(dá)到了峰值，為121.22 ng/g，隨后下降直至試驗(yàn)結(jié)束；在停藥第21 d時(shí)，鹽酸克倫特羅在肝臟中的殘留濃度為6.46 ng/g，仍在最高殘留限量(MRL)的10倍以上。肺臟與腎臟中的鹽酸克倫特羅殘留濃度在各個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)都比較接近，直到停藥第21 d時(shí)，腎臟中的鹽酸克倫特羅殘留濃度下降到最高殘留限量以下；肺臟與腎臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度均在給藥第7 d時(shí)最高，分別為31.45 ng/g和40.77 ng/g，隨后下降且消除速率相似，從停藥第7 d后，肺臟與腎臟中的鹽酸克倫特羅殘留濃度均在1 ng/g左右。鹽酸克倫特羅在心臟中的殘留濃度在整個(gè)試驗(yàn)期間都低于肝臟、肺臟、腎臟，但高于肌肉；心臟與肝臟相似，在給藥第14 d時(shí)，心臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度達(dá)到最高值，為10.14 ng/g，且在停藥第21 d時(shí)其殘留濃度為1.51 ng/g，高于肺臟與腎臟，表明心臟中的鹽酸克倫特羅消除較慢。肌肉中鹽酸克倫特羅殘留濃度最低，在給藥第7 d時(shí)，鹽酸克倫特羅殘留濃度即在肌肉中達(dá)到峰值10.41 ng/g，在停藥第21 d時(shí)降至0.15 ng/g。

表1 不同采樣時(shí)間各個(gè)組織中鹽酸克倫特羅殘留濃度(ng/g)

2.2 鹽酸克倫特羅在各組織中殘留的異同點(diǎn)分析

肝臟中鹽酸克倫特羅的殘留濃度在整個(gè)試驗(yàn)期間都高于其他組織，心臟和肌肉中鹽酸克倫特羅的殘留濃度一直處于較低水平，肺臟與腎臟中鹽酸克倫特羅的殘留量非常相近，均低于肝臟，高于心臟與肌肉。肝臟與心臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度在給藥第14 d時(shí)達(dá)到峰值，而且肝臟與心臟的消除趨勢(shì)比其他組織平緩。肺臟、腎臟與肌肉中鹽酸克倫特羅的殘留濃度在給藥第7 d時(shí)達(dá)到峰值，肌肉中的含量明顯低于肺臟與腎臟。通過對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在95%的置信區(qū)間內(nèi)，在各個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度與其在其他四種組織中的殘留濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）；給藥第7 d，肺臟與腎臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度差異顯著，給藥第14 d后，二者之間差異變?yōu)椴伙@著（P＜0.05）；從給藥第7 d到停藥第3 d，心臟與肌肉中鹽酸克倫特羅殘留濃度差異均不顯著（P＞0.05），停藥第3 d后，二者之間差異變?yōu)轱@著（P＜0.05）。從給藥第7 d到停藥第7 d的5個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度存在顯著差異（P＜0.05），停藥第7 d到第21 d差異消失（P＞0.05）；肺臟、腎臟、肌肉中鹽酸克倫特羅在給藥第7、14 d，停藥第0、3 d采樣時(shí)間點(diǎn)的殘留濃度差異顯著（P＜0.05）；停藥第3 d后，肺臟、腎臟、心臟、肌肉中鹽酸克倫特羅在各采樣時(shí)間點(diǎn)的殘留濃度無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在綿羊的可食性組織中，肝臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度最高，然后是肺臟與腎臟，心臟與肌肉中殘留濃度最低。在停藥第0 d，肝臟中鹽酸克倫特羅的殘留濃度是肺臟和腎臟的4～5倍，是心臟的11倍，這與楊靜（2011）在肉羊上的研究結(jié)果相似，而Meyer等（1991）的研究顯示，停藥第0 d時(shí)小牛肺臟中鹽酸克倫特羅的殘留濃度高于肝臟；在停藥第21 d，二者都未檢測(cè)到鹽酸克倫特羅，本試驗(yàn)還可以在五種組織中檢測(cè)到鹽酸克倫特羅，這些試驗(yàn)結(jié)果的不同，可能是由于給藥劑量與試驗(yàn)期時(shí)間不同。肺臟與腎臟中鹽酸克倫特羅殘留濃度只有在給藥第7 d存在顯著差異（P＜0.05），之后二者的鹽酸克倫特羅殘留濃度都處于同水平。在整個(gè)停藥期間，鹽酸克倫特羅在肺臟和腎臟中殘留濃度與消除模式基本一致（楊靜，2011）。鹽酸克倫特羅在動(dòng)物的不同組織中的殘留濃度不同與其跟不同組織的β-受體結(jié)合能力不同有關(guān)，也與組織間的β-受體數(shù)量和組織細(xì)胞對(duì)鹽酸克倫特羅的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同有關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果中心臟中的鹽酸克倫特羅殘留量處于低水平，雖然心臟組織中存在著豐富的β-受體，很多研究表明鹽酸克倫特羅在牛、馬和豬等動(dòng)物心臟中殘留濃度普遍偏低，說明鹽酸克倫特羅與心臟組織中的β-受體親和度不高，因此可解釋本次試驗(yàn)中心臟殘留濃度低的原因。除此之外，鹽酸克倫特羅與黑色素也有較高的親和性。Dürsch（1995）等研究表明，鹽酸克倫特羅在毛發(fā)中也有殘留，且深色毛發(fā)的殘留量要高于淺色毛發(fā)，也證明了鹽酸克倫特羅的殘留蓄積與色素有較強(qiáng)的相關(guān)性。國(guó)內(nèi)外還有很多關(guān)于鹽酸克倫特羅在動(dòng)物組織和體液中殘留的報(bào)道，Sauer等（1995）研究結(jié)果表明，在動(dòng)物的眼睛中鹽酸克倫特羅含量最高，遠(yuǎn)高于肝臟。鹽酸克倫特羅在脈絡(luò)膜（含色素上皮細(xì)胞）中的含量在整個(gè)停藥期都至少是肝臟的10倍，在眼睛各組分中的含量依次是脈絡(luò)膜＞角膜＞鞏膜＞視網(wǎng)膜＞房水/玻璃體＞晶狀體。Gojmerac（2008）報(bào)道了豬飼喂鹽酸克倫特羅后停藥第14 d眼睛脈絡(luò)膜（含色素上皮細(xì)胞）中的殘留濃度是肝臟的143倍，Meyer（1991）在研究牛眼睛中鹽酸克倫特羅殘留時(shí)表明眼睛中的殘留濃度是包括肝臟在內(nèi)的組織中的殘留濃度的20～90倍。劉士杰（2006）的研究表明，在試驗(yàn)期間豬尿液中鹽酸克倫特羅的含量變化有雙峰的趨勢(shì)，而多數(shù)研究表明在給藥期反芻動(dòng)物的尿液中鹽酸克倫特羅的殘留濃度變化范圍大，變化趨勢(shì)不明顯（Meyer，1991；Degand，1992；Sauer，1995）。李陽（2013）對(duì)綿羊進(jìn)行靜脈注射給藥的試驗(yàn)表明，唾液樣品中也存在鹽酸克倫特羅，而目前還沒有關(guān)于豬唾液中鹽酸克倫特羅殘留的報(bào)道。

4 小結(jié)

對(duì)綿羊連續(xù)給藥（15 μg/kg體重劑量）21 d后，分別取肝臟、肺臟、腎臟、心臟與肌肉組織樣品進(jìn)行分析，研究鹽酸克倫特羅在綿羊組織中的殘留規(guī)律。結(jié)果表明，在可食性組織肝臟中鹽酸克倫特羅的殘留濃度最高，代謝消除緩慢。肺臟與腎臟中鹽酸克倫特羅的殘留濃度相近，均低于肝臟。心臟與肌肉中的殘留量處于低濃度水平。所以肝臟可作為監(jiān)測(cè)鹽酸克倫特羅非法使用的靶標(biāo)。