鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus GG胞外多糖合成與提取優(yōu)化研究

■張 娟 劉 麗 高 侃 何陽春 王永俠 汪海峰

(浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安311300)

近年來，工業(yè)上對(duì)天然聚合物的需求引起人們對(duì)多糖越來越多的關(guān)注，尤其是植物多糖和微生物來源的多糖。細(xì)菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是細(xì)菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到周圍環(huán)境中的一類高分子的長(zhǎng)鏈聚合物。許多細(xì)菌都能產(chǎn)生胞外多糖，乳酸菌為主要的益生菌，其所產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)健康無任何毒副作用，是食品級(jí)多糖的來源。細(xì)菌多糖由于它們獨(dú)特的功能作用，具有作為新的綠色飼料添加劑開發(fā)應(yīng)用的廣闊前景。乳酸桿菌EPS在發(fā)酵乳的流變學(xué)特性、產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地以及口感等方面起重要作用外，還具有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能。鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）能夠定植于腸道，起到抑制病原菌的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗病毒、預(yù)防和治療腹瀉、提高免疫力等作用。然而目前乳酸桿菌EPS的產(chǎn)量不高,提取成本高,制約著其進(jìn)一步生產(chǎn)應(yīng)用。本文系統(tǒng)的對(duì)鼠李糖乳酸桿菌EPS的提取條件和合成條件進(jìn)行了優(yōu)化,旨在提高EPS的產(chǎn)量,為進(jìn)一步分離純化、研究其活性及應(yīng)用于生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus GG（美國(guó)喬治亞大學(xué)饋贈(zèng)）、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（MRS肉湯培養(yǎng)基）。

1.2 EPS含量的測(cè)定

苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試驗(yàn)流程

LGG在MRS肉湯中過夜培養(yǎng)→將過夜培養(yǎng)的LGG接種到新鮮MRS肉湯中培養(yǎng)→離心（12 000 g，10 min，4℃）除菌體和凝結(jié)蛋白→上清液中加三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）→離心除去沉淀蛋白→乙醇沉淀→離心去上清→去離子水熱溶解沉淀多糖→去離子水4℃透析（透析袋截留分子量為8～14 kDa）48 h，每8 h換水1次→冷凍干燥→得粗多糖。

1.4 EPS提取條件的優(yōu)化

TCA除蛋白條件的優(yōu)化：取LGG培養(yǎng)液離心后的上清液，分別在其中加入80%的TCA至終濃度為4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%，離心醇沉后研究不同TCA濃度對(duì)EPS提取量的影響。乙醇添加量及乙醇沉淀時(shí)間的優(yōu)化：分析不同的乙醇添加量（1、2、3、4和5倍體積95%乙醇）及乙醇沉淀時(shí)間（12、16、20、24、28、32 h）對(duì)EPS提取量的影響。

1.5 EPS合成條件的優(yōu)化

1.5.1 單因子試驗(yàn)

以EPS產(chǎn)量為測(cè)定目標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，分析不同的碳源（果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖）、葡萄糖濃度（20、25、30、40 g/l）、培養(yǎng)基初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0）、接種量（1%、2%、3%、4%和5%）、培養(yǎng)溫度（25、30、37、42 ℃）、培養(yǎng)時(shí)間（8、12、16、20、24、28 h）對(duì)EPS產(chǎn)量的影響。

1.5.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)1.5.1節(jié)單因素多水平結(jié)果，選擇對(duì)EPS產(chǎn)量具有較大影響的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值、葡萄糖濃度作為正交試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平[L9（34）]正交試驗(yàn)，優(yōu)化合成EPS的條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件的廣義線性模型（GLM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)各試驗(yàn)組之間參數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS提取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 TCA濃度對(duì)EPS提取量的影響（見圖1）

圖1 TCA濃度對(duì)EPS提取量的影響

如圖1所示，在TCA的濃度還未達(dá)到10%時(shí)，隨著TCA濃度的增加，EPS產(chǎn)量增加，超過10%，EPS產(chǎn)量開始下降。但是添加8%、10%、12%的TCA所得EPS的量沒有顯著性差異（P＞0.05）。擬合曲線如圖1，根據(jù)回歸公式，計(jì)算得出最佳TCA濃度為11%。

2.1.2 乙醇添加量對(duì)EPS提取量的影響（見表1）

表1 95%乙醇添加量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

由表1可以看出，乙醇與發(fā)酵液體積比從1增加到4的過程中，EPS提取量顯著增加，但體積比從4增加到5時(shí)，EPS提取量增加比較緩慢，并且結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）?？紤]到EPS提取量及提取成本，選擇4倍體積95%的乙醇進(jìn)行沉淀。

2.1.3 乙醇沉淀時(shí)間對(duì)EPS提取量的影響（見表2）

表2 乙醇沉淀時(shí)間對(duì)EPS提取量的影響

由表2可知，EPS提取量隨乙醇沉淀時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；在12～16 h內(nèi)，產(chǎn)量增加不明顯，16～24 h內(nèi)EPS產(chǎn)量明顯增加。但是當(dāng)醇沉?xí)r間進(jìn)一步從24 h增加到32 h時(shí)，提取量增加非常緩慢?？紤]到沉淀24、28和32 h所得EPS的量之間差異不顯著（P＞0.05），而且時(shí)間越短越可有效地利用資源，結(jié)合相關(guān)的研究結(jié)果，選擇醇沉?xí)r間為24 h。

綜合以上結(jié)果，選擇11%的三氯乙酸除蛋白，4倍體積95%的乙醇沉淀24 h，EPS提取效果較佳。

2.2 EPS合成條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度及時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

選取25、30、37和42℃ 4個(gè)培養(yǎng)溫度，測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)溫度對(duì)EPS的合成量無顯著影響（P＞0.05），兩者交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）。在這4個(gè)溫度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，它們都呈現(xiàn)一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)。在30℃和37℃均是在培養(yǎng)16 h后EPS產(chǎn)量達(dá)到最大的，而25℃和42℃均是在培養(yǎng)24 h后EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值。

表3 溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響(見表4)

表4結(jié)果顯示，培養(yǎng)基初始pH值不同，EPS產(chǎn)量也不同。其中在6.0的初始pH值下，EPS產(chǎn)量高達(dá)203.8 mg/l。初始pH值在5.5、6.5時(shí)EPS產(chǎn)量之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響(見表5)

表4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

表5 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

由表5可知，接種量不同，EPS產(chǎn)量不同，其中接種量為4%時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。但不同接種量下的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 碳源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響(見表6)

表6 碳源對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

由表6可知，在不同的碳源下，菌株所產(chǎn)EPS的量各不相同，其中以半乳糖作為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，可達(dá)到311.1 mg/l，其次為葡萄糖，EPS產(chǎn)量為295.9 mg/l，而以甘露糖為碳源所產(chǎn)的EPS量最低。在添加的7種碳源中，除半乳糖除與葡萄糖不存在顯著性差異外（P＞0.05），它與其它5種碳源都存在顯著性差異（P＜0.05），而果糖、甘露糖、乳糖和麥芽糖這4種碳源間無顯著性差異（P＞0.05）。由于半乳糖在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的成本較高，因此選擇葡萄糖作為最適碳源。2.2.5 葡萄糖濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響(見表7)

表7 葡萄糖濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

如表7所示，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖，EPS產(chǎn)量隨葡萄糖濃度的增加而增加，當(dāng)葡萄糖濃度為30 g/l時(shí)EPS產(chǎn)量最高，但進(jìn)一步增加葡萄糖的濃度時(shí)，EPS產(chǎn)量反而會(huì)降低。

2.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值、葡萄糖濃度為因素，以EPS產(chǎn)量為指標(biāo)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，正交表及結(jié)果如表8。根據(jù)正交試驗(yàn)極差R值可知，培養(yǎng)溫度是影響EPS產(chǎn)量最重要的因素，培養(yǎng)時(shí)間次之，葡萄糖濃度和培養(yǎng)基初始pH值影響較小，即影響EPS產(chǎn)量的因素主次順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞葡萄糖濃度＞培養(yǎng)基初始pH值。菌株發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳條件組合為2號(hào)試驗(yàn)組，即培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間20 h，培養(yǎng)基初始pH值6.0，葡萄糖濃度25 g/l，在此條件下，EPS產(chǎn)量可達(dá)231.5 mg/l。然而5號(hào)試驗(yàn)組（230.2 mg/l）與2號(hào)試驗(yàn)組所產(chǎn)EPS的量之間并沒有顯著性差異（P＞0.05），且葡萄糖用量較少，所以選擇其合成胞外多糖的最佳條件為：培養(yǎng)基中添加20 g/l的葡萄糖，調(diào)節(jié)其pH值為6.5，在30℃培養(yǎng)20 h。

表8 EPS提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在提取EPS的過程中，蛋白清除和多糖沉淀是兩個(gè)主要的步驟。目前常用的脫除蛋白質(zhì)的方法主要有兩種，Sevag法和TCA法。但Sevag法耗時(shí)、試劑用量大，因此本試驗(yàn)選擇TCA法除蛋白。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取EPS的最佳的TCA濃度為11%，這與Nikolic等和Pham等的試驗(yàn)結(jié)果相似，其除蛋白時(shí)所用的TCA的濃度分別為12%和10%。

在多糖的沉淀方面，Kanmani等用2倍體積無水乙醇在4℃過夜來提取EPS。劉齊等對(duì)嗜酸乳酸桿菌EPS提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出在80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇下，以1∶1.8（體積比）的料液比抽提12 h，此時(shí)得到的EPS產(chǎn)量最高。馮美琴等的試驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳酸桿菌EPS醇沉的最佳條件為：95%乙醇添加量與發(fā)酵液體積比為3.9，發(fā)酵液濃縮倍數(shù)3.54倍，醇沉?xí)r間12.56 h。本試驗(yàn)確定了乳酸桿菌LGG產(chǎn)EPS的最佳醇沉條件：4倍體積95%的乙醇4℃沉淀24 h。

溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵合成EPS的重要因素之一。大部分乳酸菌是在低于其最適生長(zhǎng)溫度的亞適生長(zhǎng)條件下或最適生長(zhǎng)溫度下EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值的。羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillus reuteri ATCC 55730）在43℃時(shí)生長(zhǎng)速率最快，而EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值的培養(yǎng)溫度卻是37℃。當(dāng)發(fā)酵溫度在31～33℃時(shí)，藏靈菇源干酪乳桿菌KL1合成EPS的產(chǎn)量最高，溫度高于33℃時(shí)EPS產(chǎn)量迅速下降，在最適生長(zhǎng)溫度37℃時(shí)EPS產(chǎn)量卻較低。在以葡萄糖或乳糖為碳源時(shí)，15℃和25℃最有利于于Lactobacillus sakei 0-1的生長(zhǎng)和EPS的產(chǎn)生；30℃時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)不好，EPS的產(chǎn)量也較低；42℃時(shí)無論以葡萄糖或乳糖為碳源都沒有EPS的產(chǎn)生，因?yàn)樵诖溯^高的溫度下基本上沒有細(xì)菌的生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度為30℃與40℃時(shí)，Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus RR在培養(yǎng)基SDM中所產(chǎn)的EPS量基本上是相同的(220 mg/l)，但是EPS在40℃的產(chǎn)生速率（11.95 mg/h）卻高于在30℃時(shí)的產(chǎn)生速率（8.04 mg/h）。本試驗(yàn)中LGG產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，低于其最適生長(zhǎng)溫度37℃。推測(cè)認(rèn)為溫度較低時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度較慢，細(xì)胞壁合成亦較慢，從而使較多的類異戊二烯脂質(zhì)載體（也參與細(xì)胞壁多聚物如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖等的生物合成）被用于合成EPS。

EPS屬于菌體產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，根據(jù)菌株來源的不同，它可以在不同的生長(zhǎng)階段產(chǎn)生。德氏乳酸桿菌保加利亞亞種EPS產(chǎn)量在18 h為最高，24 h后EPS產(chǎn)量顯著降低。乳酸桿菌Lactobacillus sakei 0-1在生長(zhǎng)的早期階段就開始產(chǎn)生EPS，對(duì)數(shù)期EPS的產(chǎn)生速率達(dá)到最大值，而當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)EPS的產(chǎn)生即停止。Pham等報(bào)道鼠李糖乳酸桿菌R以葡萄糖為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量在36 h達(dá)到最大值后開始下降；以乳糖為碳源，21 h后EPS產(chǎn)量開始下降。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，EPS產(chǎn)量逐漸增加，24 h達(dá)到最大值；在30℃和37℃的條件下均是在培養(yǎng)16 h EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值。

EPS合成的過程是一系列酶促反應(yīng)的過程，發(fā)酵液pH值的變化影響發(fā)酵過程中各種酶的活性。前人研究發(fā)現(xiàn)EPS生物合成量最大的pH范圍都是在中性偏酸的條件下，該條件下參與EPS生物合成的類異戊二烯脂質(zhì)載體的活力最強(qiáng)。本試驗(yàn)中，pH為6.0時(shí)，EPS生物合成量最大，這與前人的研究結(jié)果相似。

培養(yǎng)基組分是影響EPS產(chǎn)量的重要因素，尤其是碳源。在葡萄糖、乳糖和半乳糖中，葡萄糖最利于Lactobacillus sakei 0-1的生長(zhǎng)，同時(shí)以它為碳源，EPS產(chǎn)量也最高。Ismail報(bào)道在以乳糖（40 g/l）為碳源時(shí)，植物乳酸桿菌MTCC9510 EPS產(chǎn)量最高。Cerning等研究了不同濃度的半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和蜜二糖對(duì)Lactobacillus casei CG11產(chǎn)胞外多糖的影響，發(fā)現(xiàn)不同的碳源及其濃度都對(duì)多糖的產(chǎn)量有很大的影響，且該菌的最佳碳源為葡萄糖（20 g/l），而以乳糖和半乳糖為碳源時(shí)EPS產(chǎn)量最低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示半乳糖為鼠李糖乳酸桿菌LGG合成EPS的最佳碳源，葡萄糖其次。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明鼠李糖乳酸桿菌LGG產(chǎn)生胞外多糖的最佳條件為：在MRS肉湯中添加20 g/l的葡萄糖，調(diào)節(jié)其初始pH值為6.5，于30℃培養(yǎng)20 h。EPS最佳的提取條件為：用11%的三氯乙酸除蛋白，4倍體積95%的乙醇沉淀24 h，EPS產(chǎn)量可達(dá)230.2 mg/l。

（參考文獻(xiàn)22篇，刊略，需者可函索）