中藥抗肝癌血管生成作用研究進(jìn)展*

盛慶壽 王 武

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院(廣西 南寧，530011)

原發(fā)性肝癌按組織學(xué)分類可分為肝細(xì)胞癌(HCC)、膽管細(xì)胞癌(CC)和混合型肝癌，其中以HCC 最為常見(jiàn)，是全球第五大常見(jiàn)腫瘤，死亡率排在第三位［1］。肝癌起病隱蔽，大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已處于肝癌晚期，已經(jīng)不能接受外科手術(shù)治療。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中肝癌屬于“積聚”、“癥瘕”、“鼓脹”等病范圍，中醫(yī)腫瘤界發(fā)展了“癌毒”概念，認(rèn)為正氣虛損是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素，癌毒內(nèi)生是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，“癌毒”是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移最根本的因素［2］。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲需要依賴新生血管。血管的生成與肝癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)均有明顯的相關(guān)性。隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥中所篩選的低毒、有效的抗肝癌活性成分成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。筆者將就中藥及中藥提取物通過(guò)抑制肝癌血管生成抗肝癌方面的研究予以探討，并就其抗肝癌血管生成機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 肝癌與血管生成

肝癌是典型的富血管腫瘤，血管生成作用在肝癌生長(zhǎng)中最為典型［3］。在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的前期，其僅能夠依靠周圍組織彌散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持生長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)較為緩慢，極少發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)其直徑超過(guò)2mm 時(shí)，隨著肝癌細(xì)胞需氧量的增大，而原有扭曲擴(kuò)張的血管在運(yùn)輸血液上效率很低，內(nèi)部供血不足，很容易缺氧，氧的不足會(huì)抑制癌基因的表達(dá)或抑癌基因的失活，肝癌細(xì)胞必須要形成供給自身的血管。因此為了進(jìn)一步增殖其激活了血管生成促進(jìn)因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移并生成新的血管［4］。這些新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞相比于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的血管生成能力和藥物抵抗能力，而且血管生長(zhǎng)分布往往不規(guī)則，具有異常的血液流動(dòng)和過(guò)多的滲漏，無(wú)正常的血管功能。這種異常的血管改變最典型的表現(xiàn)是引起微脈管系統(tǒng)動(dòng)脈化和毛細(xì)血管化［3］，幫助腫瘤組織更快速的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)。肝癌血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種血管生成調(diào)控因子間相互協(xié)調(diào)，以及一些小分子物質(zhì)和基因表達(dá)的改變，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞激活、基底膜降解、增殖、遷移、管道化，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)［5］。血管生成調(diào)控因子是促進(jìn)或者抑制血管形成的一類天然物質(zhì)，在腫瘤血管生成過(guò)程中起著主導(dǎo)作用。其種類非常多，當(dāng)前研究較多的包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (transforming growth factor，TGF)、腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor，TNF)-α、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2 等。Hanahan等［6］在1996年提出“血管生成開(kāi)關(guān)”(angiogenic switch)的概念，認(rèn)為腫瘤中與血管生成相關(guān)的抑制因子和促進(jìn)因子之間的平衡被打破是腫瘤血管生成的關(guān)鍵。當(dāng)前臨床上使用的抗血管生成類靶向藥物主要分為兩大類:單克隆抗體如貝伐單抗，貝伐單抗能與人VEGF 結(jié)合并阻斷其生物活性而用于多種癌癥的治療;另一類為酪氨酸激酶抑制劑，代表藥物是索拉菲尼。索拉菲尼是一種多靶向的激酶抑制劑，其主要通過(guò)阻斷Ras-Raf-MAPK 通路直接抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［7］。這類藥物雖然能在一定程度上起到抑瘤作用，延長(zhǎng)晚期肝癌患者生存時(shí)間，但是都不可避免出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，療效并不持久［8，9］。

2 中藥抗肝癌血管生成的研究

中醫(yī)藥療法治療肝癌時(shí)來(lái)已久，在肝癌特別是晚期肝癌的治療中，中醫(yī)中藥與外科手術(shù)、介入治療、放化療相結(jié)合可明顯提高抗癌療效，減少不良反應(yīng)，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，這已得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)同。并且多種中藥及中藥提取物、中成藥、中藥復(fù)方制劑都顯示了較好的抗肝癌作用，在臨床上得到使用。近年的研究表明，某些中藥及中藥提取物或復(fù)方制劑通過(guò)抑制肝癌血管生成，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗肝癌生長(zhǎng)作用，其中部分藥物的抗血管機(jī)制已經(jīng)得到明確。目前認(rèn)為這些藥物主要通過(guò)以下幾個(gè)方面對(duì)肝癌血管生成進(jìn)行調(diào)控。

2.1 調(diào)控血管生成調(diào)控因子 在中藥及其提取物抗HCC 血管生成方面，當(dāng)前研究的較多的血管生成調(diào)控因子是VEGF、MMP 及其他因子。

2.1.1 下調(diào)VEGF 表達(dá) VEGF 及其受體VEGFR -1、VEGFR-2、VEGFR-3 等是目前發(fā)現(xiàn)最重要的一類血管生成調(diào)控因子，受體與VEGF 的結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，誘發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，而在肝癌的血管生成中起著關(guān)鍵作用［10］。其促血管生成機(jī)制涉及加速血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn)MMP 產(chǎn)生、增強(qiáng)NO 合酶(NOS)表達(dá)等。VEGF 是多種肝癌血管生成抑制劑的干預(yù)靶點(diǎn)，也是目前研究的熱點(diǎn)。貓人參根是一種廣泛用于HCC 治療的傳統(tǒng)中藥，Guo 等［11］將其分離提取物(total saponin from root of Actinidia valvata Dunn，TSAVD)作用于H22肝癌細(xì)胞和H22 肝癌大鼠模型，發(fā)現(xiàn)TSAVD 處理組的腫瘤體積和血管密度都較其他組更小。通過(guò)圖像分析系統(tǒng)定量分析提示，TSAVD 處理組的bFGF 表達(dá)低于對(duì)照組，其中高劑量組的bFGF 表達(dá)較低劑量組低，同時(shí)高劑量組的VEGF 表達(dá)也和其余兩組具有差異性。提示貓人參根通過(guò)下調(diào)VEGF 和bFGF 表達(dá)而具有顯著的抗HCC 血管生成作用。青蒿琥酯是從菊科艾屬植物黃花蒿中分離出來(lái)的活性成分，臨床上用于抗瘧治療，但近年研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。盛慶壽等［12］用免疫組化法觀察青蒿琥酯對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有下調(diào)腫瘤組織VEGF 表達(dá)的作用，從而認(rèn)為青蒿琥酯的抑瘤作用與下調(diào)VEGF 表達(dá)有關(guān)。Shirakami 等［13］發(fā)現(xiàn)兒茶素通過(guò)抑制HCC 細(xì)胞VEGF-VEGFR 軸而實(shí)現(xiàn)抗HCC血管生成作用，研究發(fā)現(xiàn)兒茶素能明顯降低HCC 細(xì)胞的VEGFR-2 和VEGF 水平，其機(jī)制可能是兒茶素對(duì)ERK 和Akt 蛋白激活的抑制減少了VEGF mRNA 表達(dá)、VEGF 的產(chǎn)生和VEGFR-2 激活，這種抗血管生成機(jī)制也在一項(xiàng)對(duì)EF24 (一種姜黃素類似物)［14］的研究當(dāng)中被提出。Jie 等［15］對(duì)黃連素的研究還發(fā)現(xiàn)，黃連素不僅能抑制HCC 細(xì)胞的VEGF 分泌和VEGF 基因轉(zhuǎn)錄，在實(shí)驗(yàn)中還觀察到這種抑制作用同時(shí)影響到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成，可能也影響到HCC 細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間可能存在的某種聯(lián)系，從而發(fā)揮其抗HCC血管生成的作用。

2.1.2 下調(diào)MMP 表達(dá) MMP 是一個(gè)蛋白水解酶大家族，TIMP 是MMP 的特異性抑制劑，兩者之間的平衡關(guān)系主要影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解代謝，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、增殖等方面起著重要的作用。同時(shí)MMP 也是一類重要的血管生成調(diào)控因子，其降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，為內(nèi)皮細(xì)胞的移行創(chuàng)造條件，也會(huì)促進(jìn)腫瘤血管生成。MMP 家族被研究的最多的是MMP2和MMP9。

較多學(xué)者研究MMP 在中藥及中藥提取物抗HCC 時(shí)的變化，并將MMP 列為血管生成的一個(gè)觀測(cè)指標(biāo)。人參皂苷是源自中藥人參中的一種活性成分，人參皂苷compound K (CK)是一種源于人參皂苷Rb1、Rb2、Rc 的人體腸道菌代謝產(chǎn)物［16］。Ming 等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，CK 處理組的人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H 相對(duì)于處理組，除了顯著地抑制細(xì)胞集落形成，抑制細(xì)胞粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力外，通過(guò)明膠酶譜檢測(cè)和蛋白質(zhì)印跡法還發(fā)現(xiàn)其中MMP2、MMP9 表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)NF-KB P65 核易位的抑制表明MMP 表達(dá)的抑制作用可能和NF-KB 信號(hào)的激活有關(guān)。青蒿素能打破人肝癌HepG2 細(xì)胞系的MMP-TIMP 平衡，而對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲力、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換起明顯抑制作用［18］。此外，苦參堿也被發(fā)現(xiàn)具有類似機(jī)制［19］。由于MMP 在腫瘤血管生成過(guò)程中的重要性，提示了這些中藥提取物或許同樣具有潛在的抗HCC 血管生成作用。

2.1.3 對(duì)其他血管生成調(diào)控因子的調(diào)控 此外，扶正抑瘤顆粒［20］和姜黃素［21］能顯著提高HepG2 細(xì)胞內(nèi)TNF-α 水平。染料木黃酮對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)的COX-2 和VEGF 表達(dá)能起到抑制作用［22］，這可能和染料木黃酮對(duì)Akt 通路和核因子kB (nuclear factor of kB，NF-kB)的抑制有關(guān)。

2.2 調(diào)控血管生成調(diào)控因子上游因子 腫瘤血管生成因子上游因子能通過(guò)對(duì)某些血管生成調(diào)控因子如VEGF 的調(diào)控，間接發(fā)揮其抗腫瘤血管生成作用。中藥及中藥提取物抑制HCC 血管生成的研究中，涉及的血管生成上游因子主要有信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 (STAT3)和NF-kB 兩大類。

2.2.1 抑制STAT3 活性 STAT3 是一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白。近年來(lái)，對(duì)STAT3 信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視，較多的研究表明STAT3 傳導(dǎo)通路可以調(diào)控肝癌血管的生成［23，24］，而最近的研究也表明很多中藥提取物都可能通過(guò)調(diào)控STAT3 信號(hào)通路途徑發(fā)揮良好的抗肝癌血管生成作用，并對(duì)STAT3 的抗肝癌機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究。Rajendran 等［25］發(fā)現(xiàn)厚樸酚通過(guò)對(duì)STAT3 上游激酶c-Src、杰納斯活化激酶(Janus Activated Kinase，JAK)1，JAK2 的抑制作用，在抑制HCC 細(xì)胞內(nèi)STAT3 的誘導(dǎo)激活方面具有時(shí)間和劑量的依賴性。而下調(diào)的STAT3 活性和其引起的酪氨酸磷酸酶SHP-1 的表達(dá)有關(guān)。STAT3 的抑制導(dǎo)致了參與HCC 細(xì)胞增殖、存活、血管生成的各自基因產(chǎn)物受到抑制，提示其潛在的抗肝癌及其他癌癥作用。相似的結(jié)論同樣出現(xiàn)在對(duì)吳茱萸堿［26］、β-七葉皂苷［27］的研究中。Peramaiyan 等［28］對(duì)南蛇藤醇的研究進(jìn)一步表明，南蛇藤醇可能在STAT3 的酪氨酰磷酸化過(guò)程中阻斷了Src 和JAKs 的協(xié)同作用。同時(shí)觀察到其對(duì)核轉(zhuǎn)運(yùn)和EGF (表皮生長(zhǎng)因子)誘導(dǎo)的STAT3 活性以及幾個(gè)受STAT3調(diào)控 的基因如細(xì)胞增殖(cyclin D1)、抗凋亡基因產(chǎn)物(Bcl-2，Bcl-xL，survivin，Mcl-1)和血管生成基因產(chǎn)物(VEGF)具有抑制作用，表明南蛇藤醇的抗肝癌作用是通過(guò)了多種機(jī)制進(jìn)行的。此外，Carlisi 等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，歐苷菊和TRAIL (腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)在HepG2，Hep3B，SK-Hep1三種細(xì)胞系內(nèi)的的聯(lián)合治療具有協(xié)同作用，歐苷菊增加了死亡受體TRAIL-R1 和-R2 總量的蛋白或者mRNA 水平，而這種作用可能也和STAT 蛋白的形成活性有關(guān)。

2.2.2 抑制NF-kB 活性 核因子kB 蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種基因啟動(dòng)子部位的kB 位點(diǎn)發(fā)生特異性的結(jié)合從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥，及免疫反應(yīng)、凋亡等多種基因表達(dá)調(diào)控，與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡有著密切聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制HCC 細(xì)胞內(nèi)NF-kB 信號(hào)通路的激活，能降低VEGF、MMP 表達(dá)而達(dá)到抑制HCC 血管生成的作用［30］。研究發(fā)現(xiàn)很多中藥提取物具有抑制HCC 細(xì)胞NF-kB 活性的作用，Yu 等［31］將各組HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)在含不同劑量(10、50、100、200μm)白藜蘆醇的無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)，對(duì)照組用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，并通過(guò)western bloting、RT-PCR 等方法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的NF-kB 活性受到明顯抑制，并觀察到VEGF 蛋白和mRNA 表達(dá)也均明顯降低。同時(shí)進(jìn)行的體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤內(nèi)增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，微血管密度下降。表明白藜蘆醇對(duì)HCC 血管生成具有抑制作用，并支持了NF-kB 信號(hào)通路對(duì)VEGF 表達(dá)有抑制作用這一觀點(diǎn)。三椏烏藥提取物［32］同樣能夠降低HCC 細(xì)胞內(nèi)NF-kB 的轉(zhuǎn)錄活性，以及IGF-1 誘導(dǎo)的VEGF 表達(dá)，其機(jī)制可能是藥物減弱了IGF-1R上游靶點(diǎn)如AKt、Atat3、ErK 的活性，而對(duì)HCC 的血管生成和細(xì)胞存活起到直接的損害作用。此外，對(duì)苦馬豆素［33］和黃芪皂苷［34］的研究也發(fā)現(xiàn)了其對(duì)HCC 細(xì)胞NF-kB 活性的抑制作用。

2.2.3 調(diào)控其他血管生成調(diào)控因子上游因子 除NF-kB 和STAT3 外，還有一些相關(guān)中藥提取物的研究指標(biāo)涉及到HCC細(xì)胞VEGF 表達(dá)和血管生成，如:牛樟芝［35］的生物制品ACMFB 具有顯著抑制HCC 腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞生存能力的作用，并能抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成活性。同時(shí)觀察到AC-MFB可以下調(diào)HCC 細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α 水平，而抑制HCC細(xì)胞內(nèi)的VEGF 產(chǎn)生。芹黃素［36］的抗血管生成活性研究除了觀察到芹黃素能下調(diào)huh-7 細(xì)胞內(nèi)的VEGF 和MMP-8 表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移的抑制和波形蛋白、I 型膠原的下調(diào)相一致，提示了波形蛋白可能是肝癌腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素并且是抗血管生成活性的靶點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

抗血管生成研究作為肝癌治療的新研究方向，給眾多的中晚期肝癌患者帶來(lái)了曙光。索拉菲尼等抗血管生成藥物的上市，在延長(zhǎng)肝癌患者生存時(shí)間，提高生活質(zhì)量方面具有著重大意義，但這些藥物仍不可避免的存在耐藥的問(wèn)題，療效并不持久。傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在肝癌治療和預(yù)防方面已經(jīng)顯示了顯著的療效。運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)中藥及中藥提取物進(jìn)行分析，不僅能使傳統(tǒng)中藥的抗肝癌療效機(jī)制得以闡明，使中藥的抗肝癌機(jī)制更加系統(tǒng)和科學(xué)，而更容易被世人認(rèn)同;同時(shí)作為抗肝癌血管生成藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)方向，具有無(wú)耐藥、低成本、低毒的優(yōu)勢(shì)，以及較強(qiáng)的臨床應(yīng)用潛在價(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景。同時(shí)近年相關(guān)研究還存在著以下問(wèn)題:①肝癌的血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，而大多數(shù)研究指標(biāo)都集中在主要的幾個(gè)血管生成調(diào)控因子上，對(duì)其他種類眾多的血管生成調(diào)控因子研究并不多。②盡管目前已經(jīng)有華蟾素、紫杉醇等抗癌中藥用于肝癌的治療并且取得較好療效，顯示了開(kāi)發(fā)中藥抗癌新藥的巨大潛力。但在中藥抑制肝癌血管生成方面，多數(shù)研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，僅限于細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)，還缺乏后續(xù)研究，尚沒(méi)有令人信服的成果出現(xiàn)。

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