蘆蒿秸稈黃酮類化合物對晚期蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物形成的抑制作用

鄧榮華，陸 敏，夏秋琴，李曉明，孔陽輝，呂麗爽,*

蘆蒿秸稈黃酮類化合物對晚期蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物形成的抑制作用

鄧榮華1,2，陸 敏1，夏秋琴1，李曉明1，孔陽輝1，呂麗爽1,*

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.青島商務(wù)學(xué)校，山東 青島 266002)

通過建立牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)模型，用熒光法測定體外晚期蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的含量，探討蘆蒿秸稈黃酮類化合物對AGEs形成的抑制效果，并對木犀草素的作用途徑進(jìn)行探索。結(jié)果表明：蘆蒿秸稈總黃酮浸膏經(jīng)AB-8樹脂分離后共收集到4組含有黃酮的洗脫組分（F-10、F-30、F-50、F-70）對AGEs的形成均具有抑制作用，抑制效果由強(qiáng)到弱為依次為F-50＞F-30＞F-10＞F-70，此結(jié)果與F-30和F-50分離純化得到的黃酮成分蘆丁和木犀草素具有較好的AGEs抑制效果相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蘆蒿秸稈對AGEs形成的抑制效果與總黃酮含量存在顯著的線性關(guān)系。另外，將木犀草素與MGO的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析顯示：木犀草素作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加和物來抑制AGEs的形成。蘆蒿秸稈黃酮類化合物可抑制體外蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的活性預(yù)示其可以作為AGEs的天然抑制劑來預(yù)防和減輕糖尿病及其并發(fā)癥。

蘆蒿秸稈；黃酮類化合物；蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是以蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸的氨基和還原糖為原料，在生理環(huán)境中發(fā)生非酶催化反應(yīng)，生成的一類穩(wěn)定的共價(jià)化合物。該反應(yīng)又稱為Maillard反應(yīng)或非酶促褐變反應(yīng)[1]。研究者最初認(rèn)為AGEs只是蛋白質(zhì)老化的標(biāo)志，以便體內(nèi)識(shí)別降解、清除老化的蛋白質(zhì)[2]。近幾年的研究表明，AGEs與糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)理有關(guān)，可以引發(fā)神經(jīng)病變、腎病、視網(wǎng)膜病變、糖尿病以及其他與組織老化相關(guān)疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥、慢性腎臟疾病等[3-5]。因此，如何抑制蛋白質(zhì)的非酶糖基化是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

二羰基化合物，如丙酮醛（methylglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等是還原糖與蛋白質(zhì)、脂類、DNA發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的活性羰基中間體也是AGEs形成的前體物質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒性、組織破壞性[6]。二羰基化合物能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，甚至破壞蛋白組織的結(jié)構(gòu)和功能，在蛋白質(zhì)糖基化過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。

蘆蒿（Artemisia selengensis Trucz）是多年生宿根性草本植物，具有藥食兩用性。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，蘆蒿具有抗氧化、降血壓、抑菌、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等生物活性[10-15]。蘆蒿是南京的特色蔬菜，通常廢棄或焚燒其秸稈，為進(jìn)行蘆蒿秸稈綜合開發(fā)，以提高其附加值，本實(shí)驗(yàn)前期已研究了黃酮類化合物的富集純化工藝[16]及其具有的清除自由基活性[17]。而對蘆蒿抑制AGEs形成、減輕和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的生理功能尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albuminmethylglyoxal，BSA-MGO）的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)模型，探討了蘆蒿秸稈提取物各洗脫組分及黃酮單體對AGEs形成的抑制作用，并分析了木犀草素的作用途徑，為預(yù)防糖尿病及其糖尿病并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿秸稈采集于南京八卦洲，選擇9月份完全成熟的整株秸稈，洗凈瀝干后，烘至恒質(zhì)量，粉碎后備用。

BSA 生工生物工程（上海）股份有限公司；40%丙酮醛 美國Sigma公司；甲醇、乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二甲基亞砜均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilane chemically bonded silica，ODS） 美國Sunchrom公司；硅膠（Silica gel 40，0.2～0.5 mm） 德國Merck公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 美國GE Healthcare公司；制備型厚薄層層析硅膠板 煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）（配有電噴霧離子源（elaectrospray ionization，ESI）） 美國安捷倫公司；Infinite 200Pro TECAN 奧地利Tecan有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆蒿秸稈總黃酮提取及分離純化

取蘆蒿秸稈粉（600 g），用70%乙醇按料液比1∶15（m/V）攪拌浸提2 次，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間分別為30 min和60 min。合并提取液，于40 ℃減壓濃縮得蘆蒿秸稈提取物濃縮液[19]。石油醚萃取數(shù)次去除葉綠素、油脂等雜質(zhì)，醇沉法除去其中的大部分蛋白質(zhì)和多糖[20-21]。于45 ℃將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，提取物經(jīng)冷凍干燥備用。

通過對比NKA-Ⅱ、AB-8、HPD417、DM130、D101、HPD826、ADS-17、聚酰胺8種樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能，篩選出性能最佳的AB-8大孔吸附樹脂作為本實(shí)驗(yàn)樹脂，最優(yōu)條件參照文獻(xiàn)[16]。將經(jīng)預(yù)處理的蘆蒿秸稈提取物上樣AB-8大孔樹脂，采用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇依次梯度洗脫得到5種不同洗脫組分，將不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分冷凍干燥分別得到F-10、F-30、F-50、F-70 初步分離組分。

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法進(jìn)行測定吸光度A[22]，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線ρ=0.090 4A－0.000 9（R2=0.999 9）得到總黃酮質(zhì)量濃度（ρ，mg/mL），并換算為每克干質(zhì)量樣品中總黃酮的質(zhì)量（mg）。

將總黃酮含量最高的AB-8洗脫組分（F-30、F-50）分別經(jīng)ODS柱，硅膠柱分離純化，Sephadex LH-20進(jìn)一步純化，并結(jié)合薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）跟蹤檢測，得到化合物1和化合物2。

1.3.2 高效液相色譜及質(zhì)譜分析條件

采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對其化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

化合物1：采用Agilent1200型高效液相色譜分析。用甲醇溶解樣品，色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱；流動(dòng)相：A為水-0.01%乙酸、B為乙腈，梯度洗脫：0～10 min（10% B）；10～20 min（10%～60% B）；20～25 min（60% B）。流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；波長：350 nm。DAD檢測器：Scan（200～600 nm）。

化合物2：采用HPLC-ESI-MS分析。用甲醇溶解樣品，色譜條件：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱；流動(dòng)相：A為水-0.5%甲酸、B為乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫：0～10 min（12% B），10～30 min（12%～20% B），30～40 min（20%～30% B），40～48 min（30%～60% B），48～49 min（60%～12% B），49～55 min（12% B）。流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長：254 nm。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI；負(fù)離子檢出模式；噴霧壓力310.28 kPa；干燥器溫度350 ℃；干燥氣流速11 L/min；毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓3.5 kV；分子質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～1 500 u；載氣為高純度氮?dú)狻?/p>

1.3.3 體外蛋白糖基化抑制實(shí)驗(yàn)

反應(yīng)液：BSA 2.8 mg/mL，MGO 1 mmol/L，臨用前用pH 7.4，0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）配制。

蘆蒿秸稈AB-8樹脂梯度洗脫物，用PBS配制成2 mg/mL溶液。將上述反應(yīng)液1 mL于具塞試管中，分別加入蘆蒿秸稈梯度洗脫物樣品溶液1 mL，并將試管密封為樣品組，以PBS溶液代替樣品溶液為空白組。置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d，形成糖基化修飾的白蛋白（AGE-BSA）[23]。

將蘆丁和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品，用少量的二甲基亞砜溶解，用pH 7.4 PBS分別配制成0.5、1、2、5 mmol/L。將上述反應(yīng)液與樣品溶液各1 mL等體積混合，將試管密封為陽性組，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d，形成AGE-BSA。

利用AGE-BSA在激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長450 nm有特征性吸收光譜，采用熒光光譜分析法測定其形成的AGE-BSA含量。代入下式計(jì)算AGEs抑制率。

1.3.4 木犀草素與MGO反應(yīng)產(chǎn)物的分析

將木犀草素與MGO以物質(zhì)的量比1∶10與pH 7.4、0.2 mol/L PBS混合，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Sephadex LH20凝膠分離純化，按照1.3.2節(jié)化合物2的HPLC-MS條件對其純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS StatistiVcs 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果以x±s表示，顯著性檢驗(yàn)為t檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆蒿秸稈AB-8大孔吸附樹脂洗脫組分總黃酮含量

表1 AB-8梯度洗脫物黃酮含量Table 1 Flavonoid contents of fractions eluted from AB-8 resin

如表1所示，F(xiàn)-50組分總黃酮含量最高，達(dá)958 mg/g干質(zhì)量；F-30組分次之，為893 mg/g干質(zhì)量。F-10、F-70組分總黃酮含量明顯小于F-30和F-50組分。

2.2 蘆蒿秸稈AB-8樹脂梯度洗脫組分對AGEs的抑制作用

圖1 蘆蒿秸稈AB-8梯度洗脫物對AGEs的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of four elution fractions from AB-8 resin on the formation of AGEs

由圖1可知，各梯度洗脫物對AGEs形成的抑制效果存在顯著性差異，抑制效果由強(qiáng)到弱依次為F-50＞F-30＞F-10＞F-70。在BSA-MGO模型中，F(xiàn)-50對AGEs的抑制率達(dá)78.84%；F-30對AGEs的抑制率為66.82%。

2.3 蘆蒿秸稈分離組分對AGEs抑制率與總黃酮含量之間的關(guān)系

圖2 總黃酮含量與AGEs抑制率的線性關(guān)系（BSA-MGO模型）Fig.2 Linear relationship between inhibition of AGE formation and total flavonoid contents in the BSA-MGO model

由表1和圖2可知，總黃酮含量與AGEs抑制率存在一定的線性關(guān)系（R2=0.948）。由此可推斷蘆蒿秸稈提取物對AGEs形成的抑制作用與總黃酮含量密切相關(guān)。代入方程y=0.076 5x＋4.456 6計(jì)算得，蘆蒿秸稈中黃酮類化合物對BSA-MGO模型產(chǎn)生的AGEs半數(shù)抑制濃度為IC50=591 mg/g干質(zhì)量。

2.4 蘆蒿秸稈組分（F-30和F-50）主要成分

鑒于蘆蒿秸稈分離組分F-50和F-30具有高活性抑制AGEs形成的功效，本研究對兩組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

通過對F-30組分進(jìn)一步分離得到化合物1：黃綠色粉末，溶于氯仿、丙酮、甲醇等有機(jī)試劑，不溶于水。HPLC-MS分析結(jié)果如圖3所示，保留時(shí)間為15.173 min，單峰；ESI-MS m/z609.2 [M－H]－，則化合物1的分子質(zhì)量為610 D，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果一致，由此可判斷化合物1為蘆丁。

圖3 化合物1液相色譜（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.3 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 1

圖4 化合物2液相色譜（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.4 HPLC chromatogram (A) and mass spectrum (B) of compound 2

通過對F-50組分進(jìn)一步分離得到化合物2：淺黃色粉末，溶于乙醇、甲醇溶液，不溶于冷水。HPLC-MS分析結(jié)果如圖4所示，出峰保留時(shí)間47.325 min，單峰；ESI-MS m/z 285 [M－H]－，則化合物2的分子質(zhì)量為286 D，與木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的分析數(shù)據(jù)一致，由此可判斷化合物2為木犀草素。

2.5 蘆丁、木犀草素對AGEs的抑制作用

由圖5可知，木犀草素和蘆丁均能夠顯著抑制AGEs的形成，且抑制效果均隨著濃度的增加而提高。分析數(shù)據(jù)可知木犀草素在濃度為0.5～2.5 mmol/L之間無顯著性差異，而蘆丁在濃度為0.25～1.0 mmol/L之間差異性顯著。在濃度為2.5 mmol/L時(shí)，蘆丁AGEs抑制率達(dá)到89%；木犀草素在濃度為1 mmol/L時(shí)， AGEs抑制率為81%。在濃度低于1 mmol/L時(shí)，木犀草素的抑制效果優(yōu)于蘆丁，說明木犀草素捕獲MGO的能力強(qiáng)于蘆丁，木犀草素在低濃度下，仍具有較強(qiáng)的捕獲二羰基化合物的能力，可以作為AGEs的天然抑制劑。

圖5 木犀草素和蘆丁對AGEs的抑制作用（BSA-MGO模型）Fig.5 Inhibitory effects of luteolin and rutin on the formation of AGEs in the BSA-MGO model

2.6 木犀草素與MGO作用途徑

圖6 木犀草素與MGO反應(yīng)產(chǎn)物液相色譜（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.6 HPLC (A) and mass spectrum (B) of the adduct formed from the reaction between luteolin and MGO

由圖6可知，準(zhǔn)離子峰m/z 357[M－H]－，推斷該產(chǎn)物的分子質(zhì)量為358 D。而木犀草素分子質(zhì)量為286 D，產(chǎn)物的準(zhǔn)離子峰357[M－H]－恰為木犀草素與MGO的加合物[286＋72－H]－，由此推測木犀草素與MGO反應(yīng)方程式：C15H10O6（木犀草素）＋C3H4O6（MGO）→C18H14O8（加合物）。

木犀草素與MGO反應(yīng)后，產(chǎn)物為木犀草素與MGO的加合物，表明木犀草素抑制AGEs形成的作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加合物來抑制AGEs的形成，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道其他黃酮類化合物作用途徑相一致[24-25]，而其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步考證。

3 討 論

近年來，蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)作為糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理的有力學(xué)說已得到醫(yī)學(xué)生物學(xué)界的普遍認(rèn)可。研究發(fā)現(xiàn)[26-29]，二羰基化合物在人體血漿中的濃度為0.3～1.5 μmol/L，而在糖尿病患者體內(nèi)濃度很高。二羰基化合物能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，甚至破壞蛋白組織的結(jié)構(gòu)和功能，在蛋白質(zhì)糖基化過程中發(fā)揮重要作用。因此，開發(fā)天然AGEs抑制劑，研究其對AGEs形成的抑制效果及作用機(jī)理，對探討非酶糖基化機(jī)制和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)建立了BSA-MGO的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)模型，結(jié)果顯示：蘆蒿秸稈AB-8梯度洗脫物對AGEs的形成均具有較好的抑制作用，抑制效果為F-50＞F-30＞F-10＞F-70，F(xiàn)-50對AGEs的抑制率達(dá)78.84%。通過對各組分總黃酮類化合物分析發(fā)現(xiàn)：蘆蒿秸稈組分對AGEs形成的抑制效果與總黃酮含量存在較為顯著的線性關(guān)系。由此推斷，蘆蒿秸稈提取物中抑制AGEs形成的主要組分為黃酮類化合物。

為探究蘆蒿秸稈中抑制AGEs形成的具體化合物，將黃酮含量最高的AB-8洗脫組分（F-30、F-50）分離得到2 種黃酮單體：蘆丁和木犀草素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二者對AGEs的形成具有低濃度，高活性的抑制效果。木犀草素在濃度為1 mmol/L時(shí)，對BSA-MGO形成的AGEs抑制率為81%。將木犀草素與MGO的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離和HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn)木犀草素的作用途徑為通過捕獲MGO，形成木犀草素-MGO加和物來抑制AGEs的形成。木犀草素因其較強(qiáng)的捕獲二羰基化合物的能力，可以作為AGEs的天然抑制劑。

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Inhibitory Effect of Artemisia selengensis Straw Flavonoids on the Formation of Advanced Glycation End Products (AGEs)

DENG Rong-hua1,2, LU Min1, XIA Qiu-qin1, LI Xiao-ming1, KONG Yang-hui1, Lü Li-shuang1,*
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Qingdao Commerce School, Qingdao 266002, China)

The inhibitory activity of flavonoids from Artemisia selengensis straw against the formation of fluorescent advanced glycation end products (AGEs) was evaluated in a bovine serum albumin-methylglyoxal (BSA-MGO) model. The formation of total AGEs could be generally followed by measuring their characteristic fluorescence at the excitation and emission maxima of 370 and 440 nm, respectively. Results indicated that 4 elution fractions (F-10, F-30, F-50 and F-70) obtained with AB-8 resin from the flavonoid extract of Artemisia selengensis straw revealed significant inhibitory activities against the formation of AGEs in decreasing order: F-50 ＞ F-30 ＞ F-10 ＞ F-70, which was consistent with the inhibitory effects of rutin and luteolin purified from F-30 and F-50 against the formation of AGEs. Meanwhile, the inhibitory activities of elution fractions were found to be linearly correlated with their total flavonoid contents. The adduct formed from the reaction between luteolin and MGO was purified, and LC-MS analysis showed that luteolin might have the potential to inhibit the formation of AGEs by trapping MGO to form a di-MGO conjugated adduct. Our findings showed that the flavonoids from Artemisia selengensis straw could inhibit the formation of AGEs in vitro, implying their potential use as a new inhibitor for preventing and alleviating diabetes and diabetes-related complications.

Artemisia selengensis straw; flavonoid; advanced glycation end products (AGEs)

TS201.2

A

1002-6630（2014）09-0123-05

10.7506/spkx1002-6630-201409025

2013-06-13

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目（CXLX11_0893；CXLX12_0417）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012850）；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12KJB5500005）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY12C15001）

鄧榮華（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱怨δ芤蜃臃蛛x及活性。E-mail：lovedrh_123@163.com

*通信作者：呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的分離純化、生物活性及其構(gòu)效。

E-mail：lishuanglv@126.com