大鼠脊髓損傷后對巢蛋白及突觸素Ⅰ表達的影響

申福國 孔維麗 劉士臣 崔緒民 崔宏宇 趙中南 張富運 宋春雨 楊建華

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.011

基金項目：黑龍江省自然基金（D201160）;黑龍江省教育基金（12511539）

作者單位：154002黑龍江省佳木斯，佳木斯大學第一附屬醫(yī)院骨科（申福國、劉士臣、崔宏宇、趙中南、張富運、宋春雨、楊建華），內(nèi)分泌科（孔維麗）;鶴北林業(yè)局醫(yī)院外科（崔緒民）

通信作者：楊建華，Email： jianhua01@163.com

【摘要】目的探討同種異體骨髓單個核細胞（BMMNCs）移植對脊髓全橫斷損傷區(qū)局部微環(huán)境中巢蛋白和突觸素Ⅰ表達的影響及意義。方法120只清潔級Winstar大鼠（雌雄不拘）隨機（隨機數(shù)字法）取87只分為3組。假手術(shù)組29只：切除相應(yīng)的椎板不損傷脊髓;模型組29只：建立脊髓全橫斷模型;細胞移植組29只：建立脊髓全橫斷模型后，給予BMMNCs移植治療。各組大鼠分別于5 d、1周、2周、4周利用免疫組織化學技術(shù)、RT-PCR檢測脊髓組織中巢蛋白（nestin）與突觸素Ⅰ（Synapsin I）的表達變化及利用MIAS-2000圖像處理系統(tǒng)分析觀察 nestin 和Synapsin I陽性產(chǎn)物在脊髓的分布，并測量陽性產(chǎn)物的吸光度值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，組間比較， 方差齊者采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析，樣本間的兩兩比較用q檢驗;方差不齊者用成組設(shè)計多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法），樣本間兩兩比較的秩和檢驗（Nemenyi法）;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果免疫組織染色、RT-PCR及圖像處理系統(tǒng)分析結(jié)果顯示模型對照組在傷后約5 d可見損傷區(qū)域附近nestin表達升高，2周達高峰，4周后 nestin表達明顯下調(diào)，細胞移植組在脊髓傷5 d可見損傷區(qū)域附近nestin表達升高，1周達高峰，4周后 nestin表達明顯下調(diào)，且各時期與假手術(shù)組、模型組相比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。損傷5 d后，在損傷區(qū)域出現(xiàn)突觸素Ⅰ的表達，但模型組、細胞移植組突觸素Ⅰ的表達量在各時間點均低于假手術(shù)組，細胞移植組高于模型組（P<0.01）。結(jié)論同種異體的骨髓單個核細胞移植可能改變了局部的微環(huán)境并上調(diào)了脊髓內(nèi)巢蛋白和突觸素Ⅰ的表達。

【關(guān)鍵詞】骨髓單個核細胞;脊髓全橫斷損傷;細胞移植;巢蛋白;突觸素I ;脊髓損傷;免疫組化;反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)

Effect on the expression of nestin and synapsin I after spinal cord injury in rats

Shen Fuguo*，Kong Weili，Liu Shichen，Cui Xumin，Cui Hongyu，Zhao Zhongnan，Zhang Fuyun，Song Chunyu，Yang Jianhuan，*Department of Orthopedics Surgery， First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002， China

Corresponding author： Yang Jianhua， Email： jianhua01@163.com

【Abstract】Objective To investigate the effects and significance of site transplantation of allogenic bone marrow mononuclear cells （BMMNCs） on the expression of nestin and synapsin I in the local microenvironment of transected injury zone in spinal cord.Methods From a pool of 120 clean grade Wistar rats （Irrespective of gender）， 87 rats were randomly （random number） selected and subdivided into three groups. Sham operation group （n= 29） had laminectomy done without inducing spinal cord injury. The model control group （n= 29） had laminectomy done followed by induction of complete spinal cord transected injury. Cell transplantation group （n= 29） had BMMNCs transplantation initiated after induction of complete spinal cord transected injury. Nestin and Synapsin expressions in all rats of each group were assessed on day 5， week 1， week 2 and week 4， respectively by using immunohistochemical and RT-PCR techniques. Spread of Nestin positive and Synapsin I positive products along the spinal cord were assessed by use of MIAS-2000 image processing system analysis. Optical density of these products was then measured. Statistical data analysis was done using SPSS17.0. Uniform variance analysis was done for inter group comparison using completely random design data， while paired sample comparison done with the Q test. For non-uniform variance， multiple samples were compared using design rank sum test with Kruskal-Wallis method， whereas paired samples rank sum test with Nemenyi method. P value of P<0.05 was regarded statistically significant， and P<0.01 regarded highly statistically significant. Results ?Immunohistochemistry， RT-PCR and image processing system analysis showed model control group had increased nestin expression within the damaged zone 5 days after injury， reaching peak level at 2 weeks then significantly down regulated 4 weeks later. In cell transplantation group， nestin expression around spinal cord injury zone increased 5 days after injury and reached the peak level at 1 week， then subsequently significantly down regulated 4 weeks later. At each interval， there were significantly statistical differences between sham surgery group and model control group and cell transplantation group （P<0.05）. Synapsin I expression appeared within the damaged area 5 days after injury， but at each interval， the expression of synapsin I in the model control group and cell transplantation group was lower than that in sham operation group. However， synapsin I in cell transplantation group was higher than that in model control group （P< 0.01）. ConclusionsAllogenic bone marrow mononuclear cells transplantation may alter the local microenvironment and up-regulate the expression of nestin and synapsin I in the spinal cord injury model.

【Key words】Bone marrow mononuclear cells; Spinal cord injury; Cell transplantation; Nestin; Synaptophysin I; Spinal cord injury; Immunohistochemistry; RT-PCR

脊髓損傷（ spinal cord injury ，SCI） 是目前發(fā)病較高，而在中國SCI患者將近有1百萬人^[1]，脊髓功能的恢復仍是目前面臨的難題，然而動物實驗已經(jīng)證實移植的骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells， BMMNCs）對脊髓損傷的治療取得了可觀的效果^[2]。巢蛋白（nestin）是神經(jīng)干細胞上的一種特異性分子標記物，它的表達活性能直接反映脊髓神經(jīng)細胞的分化及發(fā)育狀況，是研究脊髓神經(jīng)干細胞增殖、分化、遷移規(guī)律的特異指標^[3]。突觸素I （Synapsin I）主要是于突觸前膜有關(guān)的蛋白之一，它在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮了重要的作用，它的表達與突觸的再生、延伸與其功能的恢復有關(guān)^[4]。Synapsin I可影響大鼠突觸細胞的形成和軸突的延長，Synapsin I缺乏的大鼠突觸細胞形成減少，軸突的再生及延長也顯著減少^[5]。本實驗通過BMMNCs移植脊髓全橫斷模型大鼠，觀察對大鼠后肢功能及受損脊髓組織中巢蛋白和突觸蛋白表達的影響，探討脊髓損傷后的微環(huán)境中nestin和Synapsin I表達變化是否為脊髓功能恢復的機制之一。

1材料與方法

1.1實驗動物及其分組

取120只8 周齡Winstar，雌雄不拘，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級（由佳木斯大學動物中心提供）。隨機（隨機數(shù)字法）87只分為 ：細胞移植組、假手術(shù)組、 模型組，每組各29只。實驗中對動物的處置符合我國相關(guān)倫理學規(guī)定^[6]。動物在（23±2）℃飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。

1.2主要試劑及儀器

試劑：兔抗鼠nestin多克隆抗體、兔抗鼠突觸素I多克隆抗體 。SABC試劑盒（武漢博士德）、DAB試劑盒（大連寶生物工程公司），RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），淋巴細胞分離液（生物制品科技有限責任公司）

儀器：切片機、顯微鏡（德國Leica）。

1.3SCI動物模型制備、骨髓單個核細胞提取和移植

1.3.1SCI動物模型制備 將Winstar大鼠稱重并取右腹股溝中點上方 約0.5 cm處進針，用氯胺酮 （ 50 mg / kg ） + 安定 （ 2.5 mg / kg ）混合液腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥固定、 備皮、 消毒。以T9錐體棘突為中心，上下縱行切開約 1.5 cm，逐層分離直到暴露椎板和椎體棘突，用微型槍鉗咬除 T8～T10椎板至兩側(cè)關(guān)節(jié)突內(nèi)緣。用微型神經(jīng)剝離子縱行剖開硬脊膜約0.5 cm，用自制超薄刀片完全橫斷脊髓。用PBS液多次沖洗后逐層縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d每日一次給予青霉素（3萬U/kg）腹腔注射預(yù)防感染一次，早晚人工排便各一次。造模成功后因感染等因素脫失1只。

1.3.2骨髓單個核細胞提取在無菌操作條件下切取Winstar大鼠的雙下肢股脛骨，用2 mL無菌生理鹽水反復沖洗骨髓腔，用低溫離心機離心1次（1500 r/min、5 min、4 ℃）棄上清液。在低溫條件下用Ficoll密度梯度離心法^[7]分離骨髓單個核細胞。借助光學顯微鏡下計數(shù)器記數(shù)細胞個數(shù)，檢測其細胞活性約為95%后再加PBS緩沖液制成BMMNCs懸液（要求細胞含量為6×1011 L-1），配置細胞懸液放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.3骨髓單個核細胞移植

細胞移植組于椎管內(nèi)脊髓損傷區(qū)上下兩端分別注射15 μL含量為6×1011 L-1的骨髓單個核細胞懸液;假手術(shù)組只咬除 T8～T10椎板至兩側(cè)關(guān)節(jié)突內(nèi)緣不損傷脊髓，逐層縫合;模型對照組按細胞移植組的方法分別注射15 μL PBS緩沖液。

1.4免疫組織化學技術(shù)檢測及陽性細胞計數(shù)和平均吸光度值檢測

1.4.1切片常規(guī)脫蠟水化3% H₂O處理，微波修復抗原，分別滴加一抗：兔抗鼠nestin多克隆抗體和兔抗鼠突觸素I多克隆抗體，4 ℃過夜后分別滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素染色，封片觀察。

1.4.2采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)進行觀察分析觀察 nestin 和突觸素Ⅰ陽性產(chǎn)物在脊髓的分布， 分別計數(shù)各組術(shù)后第 5天、第1周及第2周和4周脊髓內(nèi)中外三個視野 1028 μm2面積內(nèi)的陽性細胞數(shù)，并測量陽性產(chǎn)物的吸光度值。

1.5RT-PCR檢測

引物設(shè)計由生工生物工程上海有限公司合成。見表1。

在各實驗動物到達存活時間點后，處死取脊髓組織標本，取損傷處上下各約5 mm脊髓。首先，分別嚴格按照RNAiso Plus、RNA PCR試劑盒說明書來提取總RNA;其次，取其濃度用紫外分光光度儀測量;再次，按照RT-PCR 試劑盒說明書合成cDNA ，起始總RNA樣品均取2 g嚴格按照反應(yīng)條件行RT-PCR反應(yīng)。以GAPDH內(nèi)參的拷貝數(shù)的比值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。引物及內(nèi)參基本信息（見表1）。

1.6統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析，①統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差（x±s）表示，②組間比較， 方差齊者采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析，3個樣本間的兩兩比較用q檢驗;方差不齊者用成組設(shè)計多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法）， 3個樣本間兩兩比較的秩和檢驗（Nemenyi法）;以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)果

巢蛋白在各組大鼠脊髓內(nèi)的神經(jīng)元均可見陽性產(chǎn)物的表達，且其定位于細胞漿內(nèi)。（見圖1A、B、C）。各實驗點的細胞移植組和假手術(shù)組較模型組的陽性細胞數(shù)及平均吸光度值均增加，且差異具有統(tǒng)計學意義 （ P< 0.05 ），細胞移植組較假手術(shù)組增加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），具體數(shù)值詳見表 2、3。

突觸素Ⅰ蛋白在各組脊髓神經(jīng)元細胞漿內(nèi)均可見細胞漿內(nèi)陽性產(chǎn)物。見圖1D、E、F。且不同時間點假手術(shù)組陽性細胞數(shù)與細胞移植組、模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;不同時間點檢測顯示細胞移植組陽性細胞數(shù)和平均吸光度值與模型組相比較明顯較多（P<0.05），這說明細胞移植組各時間點Synapsin I表達量均高于模型組。細胞移植組與假手術(shù)組相比較，各時間點陽性細胞數(shù)和平均吸光度值較?。≒<0.05），這說明細胞移植組Synapsin I表達量于不同時間點均低于假手術(shù)組，具體數(shù)值詳見表4、5。

表2結(jié)果顯示，在5 d、1周、4周時間點，脊髓內(nèi)巢蛋白陽性細胞數(shù)比較，細胞移植組高于模型組，高于假手術(shù)組，且兩兩比較差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;在2周時，細胞移植組高于假手術(shù)組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1A、B、C。

表3結(jié)果顯示，各時間點，脊髓內(nèi)巢蛋白陽性細胞數(shù)比較，細胞移植組高于假手術(shù)組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）; 在4周時，細胞移植組高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1A、B、C。

表4結(jié)果顯示，各時間點， 脊髓內(nèi)突觸素I蛋白陽性細胞數(shù)比較，細胞移植組高于模型對照組，低于假手術(shù)組，且兩兩組間比較差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1D、E、F。

表5結(jié)果顯示，各時間點， 脊髓內(nèi)突觸素I蛋白陽性細胞平均吸光度比較，細胞移植組高于模型組，低于假手術(shù)組，且兩兩組間比較差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1D、E、F。

2.2RT-PCR檢測結(jié)果

巢蛋白RT-PCR結(jié)果見圖2A，從表6中相對吸光度比值分析可見：在不同時間點受損的大鼠脊髓組織中nestin mRNA表達量細胞移植組與假手術(shù)組、模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;且在各時間點細胞移植組的脊髓組織中nestin mRNA表達量與模型組比較明顯較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

突觸素I RT-PCR結(jié)果見圖2B，從表7中OD相對比值分析可見：假手術(shù)組大鼠脊髓內(nèi)可見少量Synapsin I mRNA的表達，假手術(shù)組大鼠脊髓內(nèi)Synapsin I mRNA的表達水平顯著高于模型組（P<0.01），細胞移植組Synapsin I mRNA表達水平顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見表7。

表6結(jié)果顯示，各時間點， Nestin（吸光度值）/GAPDH（吸光度值）比較，細胞移植組高于模型組，高于假手術(shù)組;且組間兩兩比較差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2A。

表7結(jié)果顯示，在5 d、1周、4周時間點， Synapsin I（吸光度值）/GAPDH（吸光度值）比較，細胞移植組高于模型組，但低于假手術(shù)組;然而組間兩兩比較差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）; 在2周時，細胞移植組高于模型組，且差別均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;見圖2B。

3討論

?近年來有關(guān)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復的研究一直是神經(jīng)-生物科學領(lǐng)域的熱點。采用干細胞移植的方法來治療急性脊髓損傷修復的研究受到了基礎(chǔ)和臨床科研工作者的青睞。許多動物實驗研究均已經(jīng)證實胚胎干細胞^[8]、血管內(nèi)皮祖細胞^[9]和骨髓單個核細胞^[10]等細胞能對脊髓損傷有一定的修復作用。研究證明骨髓單個核細胞移植到損傷的脊髓后能可以在宿主脊髓中存活、發(fā)育、遷移和分化為新生的血管和神經(jīng)元并分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和形成神經(jīng)連接，促進神經(jīng)組織的修復，改善其神經(jīng)功能^[11-12]。但其治療機制仍不十分清楚。

?本實驗通過骨髓單個核細胞移植并觀察脊髓損傷區(qū)附近nestin和SynapsinⅠ的表達，通過免疫組織化學技術(shù)及RT-PCR結(jié)果均表明受損傷大鼠脊髓的神經(jīng)功能恢復與nestin、SynapsinⅠ表達有一定的相關(guān)性。

研究表明，nestin是一種中間絲蛋白，可作為神經(jīng)干細胞的免疫標志物，只在多潛能的神經(jīng)外胚層細胞中表達，隨著神經(jīng)上皮的分化、成熟而逐漸消失，但在少數(shù)保持神經(jīng)發(fā)生功能的部位，nestin仍有表達，如大腦室管膜下區(qū)、脊髓中央管室管膜層也存在著大量未分化細胞^[13]。本實驗觀察到，在免疫組化技術(shù)nestin的陽性反應(yīng)物主要存在于胞漿中，細胞核也有陽性反應(yīng)物存在，其鏡下免疫染色呈棕褐色或棕色。假手術(shù)組的脊髓內(nèi)nestin很少表達，模型組的脊髓損傷后使得巢蛋白表達增強，細胞移植組較模型組表達更強，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。從各時間點上看到，細胞移植組與假手術(shù)組相比：術(shù)后5 d、1周、2周，各點巢蛋白表達均較多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且1周時表達量較2周時高，以后逐漸減少，4周時表達量較假手術(shù)組少，這可能與SCI后期神經(jīng)元細胞的變性、死亡或移植的細胞量減少等有關(guān)。這與李俊岑等^[14]的研究結(jié)果相似，他們研究發(fā)現(xiàn)大鼠在脊髓損傷后在傷后第24 h，nestin陽性表達開始出現(xiàn)，傷后第5天達高峰、2 周呈下降趨勢， 還提示脊髓內(nèi)神經(jīng)細胞的增殖活性與脊髓損傷的類型、嚴重程度和損傷的時間長短呈負相關(guān)。因此，nestin作為神經(jīng)干細胞的免疫細胞標志物，其表達量的多少和峰值是否提前均可提示神經(jīng)細胞的增殖情況。在RT-PCR結(jié)果顯示細胞移植組nestin mRNA的表達量明顯高于模型組。以上實驗結(jié)果均提示BMMNCs可改善SCI大鼠后肢運動功能的恢復且可能與脊髓內(nèi)nestin mRNA的表達上調(diào)有關(guān)。以上實驗結(jié)果均提示BMMNCs能夠使脊髓內(nèi)nestin mRNA的表達上調(diào)，可能改善局部損傷的微環(huán)境，防止脊髓的繼發(fā)性損傷有關(guān)。

另外，研究證實突觸素I是存在突觸囊泡膜上的一種特異性蛋白質(zhì)，在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、轉(zhuǎn)運、信息傳遞和神經(jīng)元突觸的發(fā)生及可塑性的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，SynapsinⅠ其免疫陽性產(chǎn)物主要存在于脊髓灰質(zhì)內(nèi)且免疫染色呈棕褐色或棕色，常見于神經(jīng)細胞突起，呈點狀、顆粒狀分布。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，細胞移植組與假手術(shù)組SynapsinⅠ的表達量逐漸增多，且于術(shù)后3 周時達高峰;細胞移植組和模型組相比可見各觀察點的SynapsinⅠ表達較少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這可能是脊髓在創(chuàng)傷后神經(jīng)元細胞和軸突的變性、壞死、退變、凋亡等致SynapsinⅠ來源減少有一定相關(guān)性^[15]。從免疫組化技術(shù)及RT-PCR檢測均可表明，BMMNCs移植后可使受損的脊髓組織內(nèi)SynapsinⅠ mRNA的表達上調(diào)。這與Akiyama等^[16]研究相似，更證明了骨髓單個核細胞移植增加了中樞和外周髓鞘上軸突間的傳導速度和蛋白表達，且均改善了實驗大鼠后肢神經(jīng)功能。實驗表明Synapsin I在正常大鼠脊髓組織和受損傷脊髓組織中均有一定表達，且受損傷脊髓組織中表達量低于正常脊髓組織，細胞移植組Synapsin ImRNA表達量均高于模型組、低于假手術(shù)組，提示BMMNCs通過上調(diào)神經(jīng)元內(nèi)突觸素I表達，可能促進了神經(jīng)元細胞軸突的再生和調(diào)控了突觸的形成、可塑性。

目前在動物實驗中骨髓單個核細胞移植治療SCI已經(jīng)取得了一定的療效^[17-20]，但移植的骨髓單個核細胞在受損的脊髓內(nèi)存活、分化及增殖的具體機制尚不明確。根據(jù)本實驗研究結(jié)果， SCI損傷處附近的nestin和SynapsinⅠ表達的明顯增高，這可能是移植的骨髓單個核細胞改變了脊髓橫斷處局部的微環(huán)境，這種改變有利于神經(jīng)干細胞或前體細胞的激活與生存有利于防止脊髓的繼發(fā)性損傷。所以SCI恢復的過程是多因素共同作用的結(jié)果，受損脊髓組織中nestin和Synapsin I的表達上調(diào)可能是BMMNCs改善SCI大鼠脊髓功能的機制之一。

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（收稿日期：2014-06-19）

（本文編輯：何小軍）

p1348-1354