杜仲C4H基因cDNA全長序列特征分析

李鐵柱，杜紅巖，王 淋

(1.中國林業(yè)科學研究院 經濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004)

杜仲是我國傳統(tǒng)的藥用植物，葉片和果實中含有大量的綠原酸等活性成分[1-5]，肉桂酸-4-羥化酶(Cinnamic Acid 4-Hydroxylase，C4H)，是綠原酸合成途徑中的關鍵酶[6]。

肉桂酸-4-羥化酶也叫苯乙烯酸4-脫氫酶，C4H分布在微粒體中，能夠原位利用PAL催化產生的苯乙烯酸。C4H是細胞色素單加氧酶P450超家族的成員之一，該酶由Russell和Conn首次從豌豆芽中發(fā)現[7]，它是苯丙素類化合物生物合成途徑里繼PAL(苯丙氨酸脫氨酶)之后的第2個關鍵調節(jié)酶[8-9]。擬南芥的C4H為單一位點編碼，基因啟動子在PAL和4CL基因中的順式作用組分也有保留，它控制著對紫外線照射、光和elicitor激活因子處理反應，C4H基因編碼的mRNA以及蛋白質的調節(jié)是嚴格與苯丙氨酸脫氨酶的 mRNA和蛋白質同步調節(jié)的，以此普遍認為肉桂酸-4-羥化酶是苯丙素類物質代謝中一個調節(jié)點。由于肉桂酸-4-羥化酶基因在植物次生代謝中有這些重要的作用，因此受到關廣泛關注。自從上世紀80年代以來，肉桂酸-4-羥化酶基因的克隆漸漸成為一個研究熱點。 迄今，已有多種植物的C4H基因被分離出來[10-11]。和苯丙氨酸脫氨酶基因類似，肉桂酸-4-羥化酶基因的拷貝數在不同植物之間存在差異。比如苜蓿C4H基因有2個拷貝，豌豆Pisumsal sativum的C4H基因只有一個拷貝，綠豆和長春花的C4H基因家族都有多個成員。這些不同植物種的C4H基因所編碼的氨基酸序列相似性極高，同源性普遍在85％左右。但玉米和法國菜豆的2個C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60％[12]。

文中對C4H基因全長cDNA序列進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，旨在為杜仲綠原酸等活性成分合成的分子調控提供理論依據。

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在中國林業(yè)科學研究院經濟林研究開發(fā)中心采集杜仲優(yōu)良品種“華仲6號”的葉片和果實，提取RNA，送至深圳華大基因公司進行轉錄組測序和基因功能注釋[13-14]。

轉錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網站上的BLAST工具，與其它物種已知的CDS序列進行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉錄組中的待分析基因。確定基因后，分析該基因(或基因家族)在杜仲葉片和果實中的表達量，推斷該基因在杜仲活性成分生物合成中的地位和作用。對杜仲膠合成時期轉錄組數據組裝及基因功能注釋和杜仲基因組測序數據進行序列生物學分析。利用 ExPASyProtParam(http://cn.Expasy.org)程序與ScanProsite程序對杜仲C4H家族各成員的氨基酸殘基數目、氨基酸殘基組成比例、基因編碼蛋白質的分子量、理論等電點以及編碼蛋白質的親疏水性等性質進行了預測與分析；利用GOR4程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)預測EuC4H蛋白質的二級結構；利用 Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)程序，根據基因氨基酸序列，在PBD(Protein data bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)數據庫搜索相似序列， 采用alignment mode建模的方式進行同源建模，預測EuC4H蛋白質的三級結構；用MEGA軟件進行遺傳系統(tǒng)分析，構建EuC4H系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

2.1 EuC4H基因與其它植物種序列相似性

EuC4H1(Unigene9197)氨基酸序列與川椒Capsicum annuum(ACF19421.1)、 紫 草Lithospermum erythrorhizon(BAB71716.1)、 馬鈴薯Solanum tuberosum(ABC69046.1)、懸鉤子Rubus occidentalis(ACM17896.1)、丹參Salvia miltiorrhiza(ABC75596.1)的C4H氨基酸序列的相似性分別為90％、90％、91％、89％、89％(見圖1)。將EuC4H1基因cDNA全長序列命名為EuC4H1。其cDNA全長為1 641 bp，編碼547個氨基酸。

另外，EuC4H2基因Unigene21793的氨基酸序列與楊樹(XP_002331408.1)、煙草(AAK62344.1)、葡萄(XP_002266037.1)、人參(AEY75219.1)、甜橙(AF255013_1)C4H氨基酸序列的相似性分別為77％、77％、79％、78％、76％，EuC4H2全長為1 611 bp，編碼537個aa。

2.2 EuC4H編碼蛋白的理化特性

用ExPaSy ProtParam程序預測EuC4H1和EuC4H2編碼蛋白的相對分子質量分別為62.94kD和60.96kD，理論等電點為9.34和8.85；氨基酸組成中都以亮氨酸、精氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量最高，蛋白不穩(wěn)定系數分別為49.91和49.67，均屬于不穩(wěn)定蛋白質。TargetP 1.1 Server工具推斷EuC4H1和EuC4H2編碼蛋白都屬分泌蛋白，分值為0.840，可靠性為3級。

2.3 EuC4H編碼蛋白的親水/疏水性分析

用Expasy Protscale程序分析杜仲C4H1和EuC4H2的編碼蛋白疏水/親水性，結果如圖2所示，EuC4H1蛋白氨基酸殘基中分別以A56和A45疏水性最強(1.971和2.049)，分別以A307、A276親水性最強(-0.996和-0.933)，親水氨基酸的數量小于疏水氨基酸，故推斷2個EuC4H編碼蛋白均為疏水性蛋白。

2.4 EuC4H編碼蛋白二級結構與保守結構域預測

以GOR4程序預測EuC4H1和EuC4H2蛋白二級結構中α-螺旋分別占46.07％和37.80％，β-折疊占15.36％和16.76％，無規(guī)卷曲結構占38.57％和45.44％，兩者均屬于混合型結構的蛋白質(見圖3和圖4)。

圖1 EuC4H全長cDNA氨基酸序列與同源序列的多重比對Fig.1 Multiple alignment of full length amino acid sequence of EuC4H and homologous sequences

圖2 EuC4H1和EuC4H2蛋白的親水/疏水性預測Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of EuC4H1and EuC4H2 proteins

保守結構域分析結果見圖5和6，EuC4H基因編碼蛋白為多結構域蛋白，屬Cypx超家族。

2.5 EuC4H編碼蛋白三級結構

采用自動建模的方式對EuC4H1蛋白進行同源建模(見圖7A)。以人的細胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)為模板，蛋白模型QMEAN 得分為0.522，與人的細胞色素P450 2D6的相似性為23.27％[15-18]。

采用自動建模的方式對EuC4H2蛋白進行同源建模(見圖7B)。以人的細胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)為模板，蛋白模型QMEAN 得分為0.516，與人的細胞色素P450 2D6的相似性為22.50％。

圖4 EuC4H2蛋白二級結構預測Fig.4 Prediction of secondary structure of the deduced EuC4H2 protein

圖5 EuC4H1蛋白的保守結構域預測Fig.5 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H1 protein

圖6 EuC4H2蛋白的保守結構域預測Fig.6 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H2 protein

圖7 EuC4H蛋白三級結構預測Fig.7 Prediction of tertiary structure of the deduced EuC4H protein

2.6 C4H基因系統(tǒng)進化樹

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)是苯丙烷類代謝途徑的第1個羥基化酶，是一種與細胞色素P450密切相關的單氧化酶，C4H能利用PAL產物肉桂酸形成對-羥基香豆酸[19]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明：杜仲中分離的基因序列也與煙草、紫草、矮牽牛的C4H蛋白聚在一起(見圖8和圖9)，說明EuC4H很可能是杜仲苯丙素類物質合成的關鍵基因，影響杜仲木質素的合成代謝。

圖8 C4H同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of C4H homologous proteins

圖9 EuC4H系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 EuC4H phylogenetic tree

3 結論與討論

杜仲肉桂酸-4-羥化酶(EuC4H)，其cDNA全長為1 641 bp，編碼547個氨基酸，EuC4H相對分子質量為62.94kD，理論等電點為9.34；氨基酸以亮氨酸、精氨酸、纈氨酸的含量較高，疏水性不穩(wěn)定蛋白質；EuC4H二級結構中α-螺旋占46.07％，β-折疊占15.36％，無規(guī)卷曲結構占38.57％，屬于混合型結構的蛋白質，屬Cypx超家族。

肉桂酸-4-羥化酶(C4H)基因相對而言，以小基因家族存在，遺傳多樣性低，保守性較高的基因，如EuC4H基因與川椒Capsicum annuumACF19421.1、 紫 草Lithospermum erythrorhizonBAB71716.1、 馬 鈴 薯Solanum tuberosumABC69046.1的氨基酸序列相似性高達90％以上。本研究在轉錄組研究的基礎上，從杜仲果實和葉片中分離鑒定了2種C4H基因。

有報道發(fā)現，肉桂酸-4-羥化酶的表達與植物的木質化進程關系密切[20]。研究歐芹肉桂酸-4-羥化酶表達模式顯示，C4H基因在木質化程度高的花梗中表達豐富，但在幼嫩葉片和成熟葉片中均不表達[21]；擬南芥的肉桂酸-4-羥化酶基因也在木質化的細胞中表達量最為豐富[22]，對肉桂酸-4-羥化酶功能系統(tǒng)研究發(fā)現，在高等植物的生長發(fā)育各階段或者各種外界因子如機械損傷、真菌感染以及化學誘導、激發(fā)子等的刺激下，肉桂酸-4-羥化酶基因編碼的mRNA積累水平和變化趨勢與苯丙氨酸脫氨酶趨于一致。因此，下一步應開展杜仲C4H基因對綠原酸生物積累的貢獻方面的系統(tǒng)研究，為C4H基因的分子調控機理研究提供依據。

[1] 杜紅巖,胡文臻,俞 銳.中國杜仲橡膠資源與產業(yè)發(fā)展報告[R].北京:社會科學文獻出版社,2013:141-144.

[2] 杜紅巖,劉昌勇,李 欽,等.杜仲葉中3種主要活性成分含量的季節(jié)變化[J].中南林業(yè)科技大學學報,2011,31(8):6-9.

[3] 杜紅巖,李 欽,杜蘭英,等.杜仲雄花茶營養(yǎng)成分的測定分析[J].中南林業(yè)科技大學學報,2007,27(6):88-91.

[4] 劉淑明,梁宗鎖,董娟娥.不同水分條件下皮葉兩用杜仲林的生長效應[J].中南林業(yè)科技大學學報,2007,27(5):49-53.

[5] 杜紅巖,劉攀峰,孫志強,等.我國杜仲產業(yè)發(fā)展布局探討[J].經濟林研究,2012,30(3):130-144.

[6] 杜紅巖.杜仲活性成分與藥理研究的新進展[J].經濟林研究,2003,21(2):58-61,82.

[7] Russell DW,Conn EE.Cinnamic Acid 4-Hydroxyiase of Pea Seedlings[J].Archives of Biochemistry,1967,122:256-258.

[8] Barber M S,Mitchell H J.Regulation of phenylpropanoid metabolism in relation to lignin biosynthesis in plants [J].Int Rev Cytol,1997,172: 243-293.

[9] 李 波,梁 穎,柴友榮.植物肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因的研究進展[J].分子植物育種,2006,4(3S): 55-65.

[10] Mizutani M,Ward E,DiMaio J,et al.Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450 possessing cinnamate-4-hydroxylase acticity[J].Biocbean Biopbys Res Commum,1993,190: 875-880.

[11] Teutsch H G,Hasenfratz M P,Lesot A,et al.Isolation and sequence of a cDNA encoding the Jerusalem artichoke cinnamate-4-hydroxylase,a major plant cytochrome P450 involved in the general phenylpropanoid pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90: 4102-4107.

[12] Nedelkina S,Jupe S C,Blee K A,et al.Novel characteristics and regulation of a divergent cinnamate 4-hydroxylase (CYP73A15)from French bean: engineering expression in yeast [J].Plant Mol Biol,1999,39: 1079-1090.

[13] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲果實和葉片轉錄組數據組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(11):122-130.

[14] 李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲幼果和成熟果實轉錄組數據組裝及基因功能注釋[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(10): 9-17.

[15] Benkert P,Biasini M,Schwede T.Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models [J].Bioinformatics,2011,27(3):343-350.

[15] Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al.The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling [J].Bioinformatics,2006,22(11),195-201.

[17] Schwede T,Kopp J,Guex N,et al.SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server[J].Nucleic Acids Research,2003,31(13):3381-3385.

[18] Guex,N,Peitsch M C.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling[J].Electrophoresis,1997,18: 2714-2723.

[19] 呂淑萍,倪志勇,范 玲.木質素生物合成相關酶基因調控的研究進展[J].分子植物育種,2011,9(3):1545-1555.

[20] Chapple C.Molecular-genetic analysis of plant cytochrome P450-dependent monooxygenases[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1998,49: 311-343.

[21] Koopman E,Logemann E,Hahlbrock K.Regulation and functional expression of cinnamate 4-hydroxylase from parsley[J].Plant Physiol,1999,119: 49-55.

[22] Bell-Lelong D A,Cusumano J C,Meyer K,et al.Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis (Regulation in response to development and the environment)[J].Plant Physiol,1997,113:729-738.