杜仲IPI基因全長cDNA克隆與生物信息學分析

劉攀峰，吳 敏，杜紅巖

(1.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003)

萜存在于幾乎所有的生命形式中，是自然界最大的一類天然產(chǎn)物家族，也是植物中種類最為繁多的一類天然產(chǎn)物[1]。萜類骨架以異戊二烯(isoprene)為基本單元，它的生物合成是由異戊 二 烯 焦 磷 酸(isopentenyl diphosphate，IPP)與其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，以及二者縮合形成中間產(chǎn)物相互之間的聚合反應[2]。異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IPI)催化IPP的碳碳雙鍵與DMAPP親電丙烯基間的可逆轉(zhuǎn)化，被視作整個萜類代謝網(wǎng)絡的一個樞紐[3-4]。目前認為有2類結(jié)構(gòu)迥異的非同源IPI蛋白家族[5-6]，I型IPI在植物中廣泛存在并且基因序列十分保守，多有2個或2個以上基因亞型存在，序列較長的I型IPI基因多定位于質(zhì)體，而較短的多定位于細胞質(zhì)；此外，線粒體、過氧化物酶體也發(fā)現(xiàn)有IPI存在。IPP可從細胞質(zhì)向各種細胞器中擴散，有研究推斷是由于IPP有膜通透性，也可能是存在一種特殊的轉(zhuǎn)運機制。II型IPI基因序列較長，一般編碼300個氨基酸以上，其活性位點幾乎分布于整個氨基酸序列[4]。

目前認為IPI為關鍵基因調(diào)控萜類代謝途徑，大腸桿菌Escherichia coli中通過外源表達IPI基因發(fā)現(xiàn)番茄紅素與類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高[7-8]；山榛Corylus avellanaL.IPI基因在根、莖、葉中均有表達且以根表達量相對較高，并有試驗推斷CaIPI能影響植株中紫杉醇的合成[9]；而有關橡膠Hevea brasiliensis(Willd.ex A.Juss.)Muell.Arg.的研究認為IPI基因的表達情況是萜類合成路徑的關鍵步驟，并認為創(chuàng)傷不會影響植株IPI基因的表達水平[10]。也有試驗指出，外界刺激對IPI活性也產(chǎn)生一定影響，在高光及高鹽環(huán)境下會誘導煙草Nicotiana tabacumL.IPI mRNA的合成，但是否會影響IPI活性尚待進一步證實。

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是世界上極少數(shù)分布于溫帶、亞熱帶能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)天然橡膠的木本植物[11-12]。杜仲膠、京尼平苷和桃葉珊瑚苷等諸多杜仲萜類具有重要的產(chǎn)業(yè)應用價值，在橡膠工業(yè)、航空航天、國防、船舶、化工、醫(yī)療、體育等國民經(jīng)濟許多部門引起廣泛關注[13-16]。對杜仲IPI基因結(jié)構(gòu)與功能開展的研究不多，本研究試通過闡明杜仲IPI基因序列、結(jié)構(gòu)特征并分析其作用機理，以期為杜仲萜類生物調(diào)控和分子育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

2011年4月下旬，在中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心采集 “華仲6號”杜仲幼嫩葉片，用清水沖洗表面雜質(zhì)后，帶回室內(nèi)于液氮中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試 劑

MightyAmp DNA Polymerase Ver.2(Takara，大連)，3’-Full RACE Core Set(Takara，大連)，M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(Takara，大連)，5’-Full RACE Kit(Takara，大連)，氯化鋰(Amresco，美國)，CTAB(Amresco，美國)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根，北京)，DH5α感受態(tài)細胞(天根，北京)，SDS(上海生工，上海)，DEPC(Sigma，德國)，pEASY-T1 Cloning Kit(全式金，北京)，PVP(Amresco，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 杜仲葉片RNA提取及單鏈cDNA的合成

通過改良CTAB-LiCl法進行杜仲葉片RNA的提取[17]，并依照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit進行杜仲單鏈cDNA的合成。

1.3.2 引物設計

由杜仲轉(zhuǎn)錄組測序中已知的IPI unigene序列，設 計 引 物 5′-TCCTTCTCTATTCGCCTCATCC-3′/5′ATGTTCGCCCCACTTCC-3′擴 增 IPI基 因 特異片段；后結(jié)合試劑盒錨定引物序列，設計3′RACE 巢 式 擴 增的 引 物 5′-CTCCTTCAGC AACGATCAGG-3′/5′-CTGAG GATGTTCCAGT CGAT-3′，以及 5′RACE 巢式擴增引物 5′-CGTCC ACACCAAAGGGAATGTTAC-3′/5′-CCACCAAA ATACATTCGTCCTC-3′。

1.3.3 基因全長的末端擴增

基因全長末端擴增反應體系與反應條件參照Takara 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0 與 Takara 5′-Full RACE Kit 說明操作。

1.3.4 基因片段回收與測序

基因片段回收按TIANGEN通用型DNA回收試劑盒進行，擴增片段連接按pEAZY-T克隆試劑盒進行，基因片段測序由金斯瑞公司(南京)完成。

1.3.5 生物信息學分析

序列相似性檢索由NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast程序完成；蛋白質(zhì)氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、理論等電點以及功能位點分析由ExPASy(http://cn.expasy.org)ProtParam 程 序 與ScanProsite程序完成；蛋白質(zhì)細胞定位及二級結(jié)構(gòu)預測由Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)以 及 PSIPRED方 法(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)完成[18]；轉(zhuǎn)運肽預測由ChloroP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)完成[19]；蛋白質(zhì)同源建模由SWISS-MODEL程序(http://swissmodel.expasy.org/)完 成[20]；蛋白質(zhì)序列多重比對由Lasergene軟件完成；基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建由MEGA 5軟件完成[21]；氨基酸序列無序性分析由在線程序FoldIndex(http://bip.weizmann.ac.il/ fl dbin/ fi ndex)完成[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲IPI基因全長cDNA序列特征

在逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板上分別擴增出3條杜仲IPI基因特異片段，測序拼接后得到1條1 231 bp的基因序列，如圖1、圖2所示。與喜樹Camptotheca acuminataDecne.(AF031079.1)、歐洲榛Corylus avellanaL.(EF553533.1)、番薯Ipomoea batatas(L.)Lamarck(AB499048.1)、 番 茄Lycopersicon esculentumMiller.(NM_001247924.1)、長 春 花Catharanthus roseus(L.)G.Don.(EU135981.1)、葛 根Pueraria lobataOhwi.(AY315650.1)IPI全長基因序列的相似性分別為84％、84％、83％、84％、83％、82％。通過ORF fi nder程序查到1個長921 bp的開放閱讀框，與歐洲榛(ABW06959.1)、葡萄Vitis viniferaL.(XP_002277935.1)、煙 草Nicotiana tabacumL.(BAB40974.1)、番茄(NP_001234853.1)、丹參Salvia miltiorrhizaBunge(ABV08818.1)、番薯(BAI47570.1)IPI氨基酸序列的相似性分別為78％、77％、72％、92％、86％、91％，確定為杜仲IPI基因cDNA全長序列，將其命名為EuIPI。

圖1 EuIPI基因RT-PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR ampli fi cation of EuIPI

圖2 EuIPI全長cDNA及推導的氨基酸序列Fig.2 Full-length sequence of EuIPI cDNA and the deduced amino acid sequences

2.2 EuIPI編碼蛋白結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 EuIPI蛋白的一級結(jié)構(gòu)

預測編碼蛋白相對分子質(zhì)量為34.65kD，理論等電點5.40；氨基酸組成以亮氨酸(12.7％)、絲氨酸(10.1％)、纈氨酸(6.9％)和丙氨酸(6.9％)含量最高，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.38，屬不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預測EuIPI亞細胞定位于葉綠體上，其中TargetP 1.1 Server預測分值為0.945，可靠性為Ⅱ級。多重比對結(jié)果顯示，EuIPI氨基酸序列包含植物IPI蛋白保守的NTCCSHPL基序和WGEHELDYLL基序，以及催化過程中所需要的Mg2+結(jié)合位點(A154、A175)和Zn2+結(jié)合位點(A107、A119、A156、A196、A206、A208)等功能位點。5 種同源IPI序列多重比對后相同的氨基酸位點達47個，植物IPI蛋白N端比大腸桿菌多出一段80～90個氨基酸殘基的蛋白序列，說明在這段區(qū)域中可能存在轉(zhuǎn)運肽，推導EuIPI蛋白轉(zhuǎn)運肽序列長70個氨基酸殘基，去除轉(zhuǎn)運肽序列后EuIPI蛋白的相對分子質(zhì)量為27.25kD(見圖3)。

2.2.2 EuIPI蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

在線預測EuIPI蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋22.55％，β-折疊13.40％，螺環(huán)結(jié)構(gòu)64.05％，屬混合型蛋白質(zhì)(見圖4)。分析結(jié)果顯示，EuIPI為多結(jié)構(gòu)域蛋白，分屬Nudix水解酶蛋白家族，包括金屬離子結(jié)合位點和nudix 基序等功能結(jié)構(gòu)(見圖5)。

2.2.3 EuIPI編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

圖3 推導EuIPI 同源序列的多重比對Fig.3 Multiple alignment of the deduced EuIPI homologous sequences

圖4 推導EuIPI蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Prediction of secondary structure of the deduced EuIPI protein

圖5 推導EuIPI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測Fig.5 Prediction of conserved domains of the deduced EuIPI protein

以人Homo sapiens IPI蛋白(2i6k)為模板對EuIPI蛋白質(zhì)同源建模，程序評測推導的EuIPI蛋白模型QMEAN4得分0.715，與模板蛋白序列相似性50.66％，從三維模型圖中可以看出EuIPI空間上以單體形式存在，主要保守基序位于分子結(jié)構(gòu)中部(見圖6)。

圖6 推導EuIPI蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測Fig.6 Prediction of tertiary structure of the deduced EuIPI protein

2.3 EuIPI蛋白功能位點預測

程序分析EuIPI基序類型分4種，含10個潛在的功能位點，包括2個蛋白激酶C磷酸化位點(SnK，26-28；SfR，50-52)；2個N端糖基化位 點(NKSR，27-30；NQSA，303-306)；3個N端豆蔻酰化位點(GAarTR，43-48；GTkvTF，140-145；GVrnAA，171-176)；3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(SgmD，73-76；SkyE，129-132；TlqE，286-289)。軟件預測出18個EuIPI蛋白翻譯后磷酸化修飾位點，包括11個絲氨酸磷酸化位 點(A16、A17、A26、A29、A31、A33、A36、A41、A49、A50、A73)，2個蘇氨酸磷酸化位點(A102、A141)以及5個酪氨酸磷酸化位點(A34、A104、A131、A159、A241)(見圖 7)。

圖7 推導EuIPI蛋白翻譯后磷酸化位點預測Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of deduced EuIPI protein

2.4 EuIPI蛋白的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用 ClustalW法對20個IPI同源蛋白進行序列比對，并用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，如圖8所示。發(fā)現(xiàn)不同來源的IPI蛋白在進化上具有較明顯的界限。其中推導EuIPI蛋白與歐洲榛IPI蛋白親緣關系最為接近，進化距離為0.061，其次為水稻Oryza latifoliaDesv.(0.075)、丹參(0.082)、玉米Zea maysL.(0.082)、毛果楊Populus trichocarpaTorr.& Gray.(0.082)和喜樹(0.089)。

圖8 IPI同源蛋白的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建Fig.8 Construction of phylogenetic tree of IPI homologous protein

2.5 EuIPI蛋白氨基酸序列的無序性分析

FoldIndex無序性分析對EuIPI氨基酸序列中共預測出2個無序化區(qū)域，分別為A87～A97，A218～A240，總的無序化氨基酸數(shù)目為34個，無序化比例達11.11％，最長的1段無序化區(qū)域包含23個氨基酸殘基(見圖9)。

2.6 EuIPI編碼蛋白的功能的初步預測

Profun 2.2 Server預測蛋白功能的結(jié)果見表1。從表1可看出，EuIPI作為酶蛋白的概率(0.770)和比數(shù)(2.690)大于非酶蛋白，并可能屬于連接酶類，參與氨基酸生物合成的可能性(概率為0.282；比數(shù)為12.813)最高，而作為植物免疫反應基因本體的可能性(概率為0.147；比數(shù)為1.727)最大。

圖9 EuIPI氨基酸序列的無序化分析Fig.9 Disordered analysis of the deduced EuIPI amino acid sequence

3 討 論

諸多植物萜類合成都需要有IPI異構(gòu)酶的參與，植物中IPI基因最早于1995年在花香基因模式植物仙女扇Clarkia breweri中分離出，后在擬南芥全基因組發(fā)現(xiàn)2個IPI編碼基因，并將其分別命名為IPI1和IPI2[5,23]，至今有近2 000余條IPI基因相關核酸序列在GenBank注冊，包括細菌、古細菌以及真核生物等。序列分析結(jié)果說明本研究從杜仲中分離出的EuIPI與其它植物IPI基因有很高的同源性，所推導EuIPI氨基酸序列包含植物IPI蛋白保守的NTCCSHPL基序和WGEHELDYLL基序，并推測出多個潛在功能位點，分析結(jié)果預示從杜仲中分離出的EuIPI為一功能蛋白的編碼基因，是高等植物IPI基因家族的新成員。

有39種IPI蛋白晶體模型在PDB數(shù)據(jù)庫中注冊，目前認為有2類結(jié)構(gòu)迥異的非同源蛋白家族作用于IPP與DMAPP間的異構(gòu)化過程。I型IPP蛋白于20世紀50年代首先被發(fā)現(xiàn)，存在于幾乎所有真核生物及細菌中，其反應過程需要2價金屬離子的參與。與II型IPI相比，I型IPI蛋白序列較短，具有保守的NXXXCXHP與EXE基序以及富甘氨酸序列，其催化機理可能依賴于通過生成3位碳正離子中間產(chǎn)物而實現(xiàn)的質(zhì)子化與去質(zhì)子作用，這個機制此前較少提出但得到來自生物信息學和酶學的試驗證據(jù)的支持[3,24]。II型IPI發(fā)現(xiàn)較晚，被認為屬于黃素酶家族，常見于缺氧、高鹽、高溫、高酸以及貧瘠等嚴酷條件生長的細菌及所有已知的古細菌中，特別是嗜熱菌Thermophilic bacteria和超嗜熱菌中極為普遍。II型IPI反應過程需要黃素蛋白、NAD(P)H以及2價金屬離子的參與，NAD(P)H被認為用于還原黃素蛋白并生成IPI蛋白與還原型FMN的中間產(chǎn)物，但黃素蛋白在反應過程中的作用機制目前尚不清楚。IPP與DMAPP之間最為可能的轉(zhuǎn)換機制為依賴于1，3位氫原子異位時的立體選擇性，但其異構(gòu)化過程究竟以那類IPI酶為主導至今還沒有定論[3]。序列分析說明本研究EuIPI編碼蛋白屬于I型IPP蛋白，但其在杜仲萜類生物合成所扮演的角色尚待進一步確定。

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