雙歧桿菌優(yōu)良菌株的篩選及耐消化道逆環(huán)境性能

熊 濤，黃巧芬，杜 曼

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

雙歧桿菌優(yōu)良菌株的篩選及耐消化道逆環(huán)境性能

熊 濤，黃巧芬，杜 曼

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

以改良MRS培養(yǎng)基作為選擇性培養(yǎng)基，初篩得75 株嚴(yán)格厭氧且菌落呈藍(lán)色的雙歧桿菌疑似菌株。在pH3.0和含3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，得到吸光度較高的11 株，并選出耐酸耐膽鹽較好的NCU712、NCU701、NCU708進(jìn)行生理生化鑒定，NCU712基本符合長(zhǎng)雙歧桿菌的特征。經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定菌株NCU712為長(zhǎng)雙歧桿菌。并在模擬人體消化道逆環(huán)境下對(duì)菌株NCU712的耐受力進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：在pH 3.5以上的人工胃液中，NCU712活菌數(shù)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而略有上升；pH 2.5時(shí)菌株NCU712的D值為30.42 min；pH 3.0時(shí)D值為92.97 min，作用2.5 h活菌數(shù)保持在107CFU/mL以上；人工腸液作用4.0 h后，活菌數(shù)保持在108CFU/mL以上；3.0 mg/mL膽鹽中培養(yǎng)24 h后，活菌數(shù)下降1（lg（CFU/mL））。說(shuō)明NCU712對(duì)人體胃腸道耐受性良好。

雙歧桿菌；篩選鑒定；消化道逆環(huán)境；耐受能力

雙歧桿菌是人體腸道正常菌群，具有促進(jìn)消化吸收[1]、通便、生物拮抗作用[2]、護(hù)肝、提高免疫力和抗癌[3]等功能。通常人體腸道內(nèi)主要有嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌。雙歧桿菌作為典型的專性厭氧菌，常用亨蓋特滾管、厭氧罐、厭氧袋及厭氧箱4 種厭氧技術(shù)培養(yǎng)，選擇性培養(yǎng)基主要有LP、 MRS、TPY、PTGY、改良MRS等，改良MRS應(yīng)用較廣泛，且添加5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal）顯色劑可初步分辨雙歧桿菌和其他乳酸菌。益生菌在腸道定殖的前提是人體消化道逆環(huán)境有良好的耐受性，不同雙歧桿菌的耐受力不同[4-6]。實(shí)驗(yàn)分別從健康新生兒糞便和成人糞便篩選出對(duì)酸和牛膽鹽具有較好耐受性的菌株，進(jìn)行生理生化、分子生物學(xué)鑒定，并探討其在模擬胃腸道環(huán)境中的存活能力，為該菌株的后期功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新生兒糞便來(lái)源于出生19 d的母乳喂養(yǎng)兒童；健康成人糞便來(lái)源于24 周歲健康女性。

1.2 培養(yǎng)基及緩沖液

改良MRS培養(yǎng)基[7]（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸三銨2.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.05，吐溫-80 1.0 mL/L。

初篩培養(yǎng)基：在改良MRS培養(yǎng)基中添加20 g/100 mL瓊脂和60 mg/mL X-Gal。

復(fù)篩培養(yǎng)基：pH 3.0改良MRS培養(yǎng)基；3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養(yǎng)基。

蛋白胨緩沖水溶液（g/L）：蛋白胨10、磷酸氫二鈉2、葡萄糖5、磷酸氫二鉀2、氯化鈉5。

1.3 試劑

人工胃液[8-9]：準(zhǔn)確取0.1 g/mL的鹽酸16.4 mL，稀釋，調(diào)節(jié)pH值分別達(dá)到2.5、3.0、3.5、4.0。分別加入胃蛋白酶終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，充分溶解后，用孔徑0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。

人工腸液：稱取KH2PO43.4 g，加250 mL蒸餾水溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 6.8，稀釋至500 mL，加入胰蛋白酶終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，充分溶解后，用孔徑0.20 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。

1.4 儀器與設(shè)備

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱 浙江義烏冷凍機(jī)總廠；YXQLS-50/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠；pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 雙歧桿菌初篩

健康新生兒及成人糞便樣品收集后置于無(wú)菌離心管中，塞緊并放于裝有冰袋的盒子帶回，于改良MRS液體培養(yǎng)基富集后，梯度稀釋，涂布初篩培養(yǎng)基平板，厭氧培養(yǎng)48 h，挑取藍(lán)色菌落純化3 次。純化后的菌株進(jìn)行厭氧需氧實(shí)驗(yàn)，挑取嚴(yán)格厭氧菌30%甘油管保存。

1.5.2 耐酸耐膽鹽復(fù)篩[10-11]

甘油管保存的菌株接入液體培養(yǎng)基活化20 h后，按1%的接種量接種到pH 3.0的改良MRS培養(yǎng)基或3 mg/mL膽鹽的改良MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)20 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值。

1.5.3 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

挑取復(fù)篩后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體顏色、大小、形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態(tài)特征。挑選革蘭氏陽(yáng)性而且具有雙歧桿菌屬基本形態(tài)特征的菌株進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化、吲哚實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、F6PPK實(shí)驗(yàn)[12]。

1.5.4 分子生物學(xué)鑒定[13-14]

利用16S rDNA分子生物學(xué)特征鑒定。通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以待測(cè)菌基因組為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。序列的同源性在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLAST工具進(jìn)行比較，基于此序列，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定待測(cè)菌的分類地位。

1.5.5 人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)[15]

取1 mL活化后的種子液離心收集菌體，棄上清液，將菌泥轉(zhuǎn)到10 mL pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0的人工胃液中，混勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取樣，梯度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.5.6 人工腸液耐受性實(shí)驗(yàn)[16]

取1 mL活化后的種子液離心收集菌體，棄上清液，將菌泥轉(zhuǎn)到10 mL人工腸液中，混勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、1.0、2.0、3.0、4.0 h后取樣，梯度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.5.7 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

在改良MRS液體培養(yǎng)基中加入牛膽鹽（3.0 mg/mL），121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。冷卻至37 ℃以下備用，將活化后的種子液以1%的接種量接種到上述處理后的培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌初篩

圖1 菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology

圖2 菌株顯微鏡觀察（×1 000）Fig.2 Microscopic observation (× 1 000)

多數(shù)雙歧桿菌具有半乳糖苷酶且活性較好，在改良MRS培養(yǎng)基中添加底物X-Gal，半乳糖苷酶水解底物釋放出吲哚，雙歧桿菌菌落顯藍(lán)色，乳酸菌和其他細(xì)菌一般為白色或淺藍(lán)色，如圖1所示。純化3 次后，挑取嚴(yán)格厭氧菌進(jìn)行鏡檢，如圖2所示，雙歧桿菌[2]是外觀變化很大的桿狀體，少許分叉成 Y、V類型，以及棍棒狀或匙狀類型，初篩得到75 株疑似雙歧桿菌。

2.2 耐酸耐膽鹽復(fù)篩

圖3 不同菌株在pH 3.0和3.0 mg/mL膽鹽的MRSC作用20 h的生長(zhǎng)情況Fig.3 Absorbance values of different strains in pH 3.0 MRSC or MRSC with 3.0 mg/mL bile salt for 20 h

復(fù)篩后，獲得11 株耐酸耐膽鹽較好的菌株，如圖3所示，挑取NCU712、NCU701、NCU708進(jìn)行生理生化鑒定（均來(lái)源于健康成人糞便）。

2.3 形態(tài)及生理生化鑒定

表1 部分生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Some physiological and biochemical tests

根據(jù)表1、2、GB 4789.34—2012《食品微生物檢驗(yàn) 雙歧桿菌的鑒定》及伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第8版，NCU712為基本符合長(zhǎng)雙歧桿菌的生理生化特征，而NCU701與NCU708不能確定，故將3 株菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

表2 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table 2 Carbohydrate fermentation tests

2.4 分子生物學(xué)鑒定

圖4 菌株NCU712的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain NCU712

將菌株的16S rDNA基因序列分析測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，NCU701、NCU708、NCU712與長(zhǎng)雙歧桿菌的同源性均達(dá)到98%以上，可確定3 株菌均為雙歧桿菌屬。且運(yùn)用專業(yè)軟件MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4所示，菌株NCU712與長(zhǎng)雙歧桿菌屬于同一個(gè)分支，16S rDNA序列分析結(jié)果顯示與長(zhǎng)雙歧桿菌的同源性最近，為99%。結(jié)合菌落形態(tài)、鏡檢觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定菌株NCU712為長(zhǎng)雙歧桿菌。

2.5 人工胃液耐受性

雙歧桿菌作為一種重要的益生菌，必須進(jìn)入人體的胃腸道逆環(huán)境且達(dá)到一定濃度方可發(fā)揮益生功能。食物通過(guò)胃的時(shí)間一般是1～2.5 h，人體胃液pH值通常在3.0左右，隨著飲食變化而波動(dòng)。這種酸性環(huán)境可激活胃蛋白酶原，從而殺滅隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的細(xì)菌。故雙歧桿菌必須具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。長(zhǎng)雙歧桿菌NCU712在不同pH值的人工胃液中的活菌數(shù)隨時(shí)間變化如圖5所示。

圖5 NCU712在不同pH值人工胃液作用不同時(shí)間的活菌數(shù)Fig.5 Changes in viable NCU712 count during inc ubation in artificial gastric fluid at different pH values

D值[17]表示在特定的環(huán)境下，殺滅90%微生物所需要的時(shí)間。由圖5可知，人工胃液pH 2.5時(shí)，D值為30.42 min；人工胃液pH 3.0時(shí)，D值為92.97 min。Li Jia等[6]的研究顯示4 種雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在pH 3.0條件下，D值接近1.1 min，與之相比，NCU712耐酸能力強(qiáng)近百倍。且當(dāng)人工胃液pH 3.5和4.0時(shí)，活菌數(shù)呈略微上升趨勢(shì)，可見(jiàn)此人工胃液pH值和胃蛋白酶已基本不影響NCU712的生長(zhǎng)。

2.6 人工腸液耐受性

益生菌經(jīng)胃進(jìn)入腸道，小腸內(nèi)存在大量、種類繁多的微生物，腸內(nèi)環(huán)境pH值大約為7.6，含有胰蛋白酶及膽汁酸等對(duì)腸內(nèi)菌群有影響的成分。因此益生菌對(duì)腸液必須具有一定耐受性，并保持106CFU/mL以上的活菌數(shù)，才能發(fā)揮益生作用。食物通過(guò)小腸的時(shí)間一般為1～4 h，由圖6可知，雙歧桿菌NCU712在人工腸液中活菌數(shù)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而下降，D值為155.32 min，可見(jiàn)菌株NCU712耐胰蛋白酶的能力較強(qiáng)。

圖6 NCU712與人工腸液作用不同時(shí)間的活菌數(shù)Fig.6 Changes in viable NCU712 counts during incubation in artificial intestinal fluid

2.7 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

腸液分泌的膽汁影響雙歧桿菌的存活，膽鹽會(huì)改變菌體外膜通透性，因此對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，甚至殺滅菌體。牛膽汁與人膽汁效力相接近，故常用于模擬人體腸道膽汁。正常人體腸膽汁鹽含量在0.3～3.0 mg/mL，汪川等[18]探索了104 株人源性乳酸桿菌對(duì)酸和膽鹽耐受性，發(fā)現(xiàn)80%以上菌株在3.0 mg/mL膽鹽中培養(yǎng)4 h后的活菌數(shù)下降2（lg（CFU/mL）），且耐酸（pH 3.0）能力普遍強(qiáng)于耐膽鹽（3.0 mg/mL）能力。劉吉成等[19]研究了雙歧桿菌在不同質(zhì)量濃度膽鹽環(huán)境下的活菌數(shù)，結(jié)果顯示在含3.0 mg/mL膽汁鹽3 h時(shí)的活菌數(shù)已下降1（lg（CFU/mL））。Li Jia等[6]的研究顯示4 株不同雙歧桿菌在3.0 mg/mL膽汁鹽中作用20 h后的活菌數(shù)下降了3（lg（CFU/mL））以上，其中長(zhǎng)雙歧桿菌下降4（lg（CFU/mL））。而NCU712在含3.0 mg/mL膽鹽的改良MRS培養(yǎng)基作用20 h后，活菌數(shù)由4.0×107CFU/mL降到1.0×106CFU/mL，下降了1（lg（CFU/mL）），可見(jiàn)NCU712對(duì)膽鹽具有一定的耐受性。

3 結(jié) 論

雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)最重要的益生菌，利用添加X(jué)-Gal的改良MRS作為選擇性培養(yǎng)基初篩得到75 株疑似雙歧桿菌，經(jīng)復(fù)篩、生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定后，確定菌株NCU712為長(zhǎng)雙歧桿菌。在胃液pH 2.5時(shí)，菌株NCU712的D值為30.42 min；胃液pH 3.0時(shí)，D值為92.97 min，作用2.5 h活菌數(shù)仍有107CFU/mL；胃液pH 3.5和4.0時(shí)，活菌數(shù)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而略有上升。NCU712在人工腸液中作用4.0 h后，活菌數(shù)仍有108CFU/mL。菌株NCU712在3 mg/mL膽鹽的改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，活菌數(shù)下降1（lg（CFU/mL））?？梢?jiàn)NCU712對(duì)人體胃腸道逆環(huán)境耐受性較好。因此長(zhǎng)雙歧桿菌NCU712具有一定的應(yīng)用潛力，其生物活性功能及應(yīng)用于食品的安全性分析還有待于進(jìn)一步研究。

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Screening of Bifidobacteria with Acquired Excellent Tolerance to Human Gastrointestinal Tract

XIONG Tao, HUANG Qiao-fen, DU Man
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Totally 75 suspected bifidobacterium were obtained in modified MRSC broth with 60 mg/mL X-Gal. Of these strains, 11 with high viability were screened by simulating the micro-environment of the human gastrointestinal tract using MRSC broth (pH 3.0) and then MRSC with 3 mg/mL bile salt for 20 h. Physiological and biochemical tests were conducted on NCU712, NCU701, and NCU708. They were all identified as B. longum via 16S rDNA sequencing. NCU712 was in line with the characteristics of B. longum. Preliminary study on its tolerance to the human digestive environment was conducted. The results showed that the viable count rose slightly with increasing incubation time when the pH of artificial gastric fluid equaled or exceeded 3.5. The death value (the time it takes to kill 90% of cells) of NCU712 was 92.97 min and 30.42 min in artificial gastric fluid at pH 2.5 and pH 3.0, respectively. The number of viable NCU712 cells remained more than 107CFU/mL after 2.5 h. The number of living bacterium remained above 108CFU/mL after 4.0 h in artificial intestinal fluid. The number of viable NCU712 cells was reduced by one order of magnitude after being incubated in MRSC with 3 mg/mL bile salt for 24 h. In summary, B. longum NCU712 has excellent tolerance to the human gastrointestinal tract and may be regarded as functional probiotic with great application potential.

Bifi dobacterium; screening and identification; gastrointestinal tract; tolerance

Q93-3

A

1002-6630（2014）13-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201413031

2013-09-13

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100904）；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目（SKLF-ZZA-201303）；江西省教育廳科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（贛財(cái)教[2011]243號(hào)）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橐嫔按笞诠吒咧祷?。E-mail：xiongtao0907@163.com