銀杏種仁蛋白分離純化及其抑菌活性

吳海霞，吳彩娥*，范龔健，李婷婷，應(yīng)瑞峰，華 菁

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.運城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運城 044000；3.南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

銀杏種仁蛋白分離純化及其抑菌活性

吳海霞1,2，吳彩娥1,3,*，范龔健1,3，李婷婷1,3，應(yīng)瑞峰1,3，華 菁1

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.運城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運城 044000；3.南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

從銀杏種仁中分離純化具有抑菌活性的蛋白質(zhì)，并分析其抑菌活性。結(jié)合抑菌活性分析，采用硫酸銨分級鹽析、透析、纖維素DE-52陰離子交換柱層析及Sephadex G-75凝膠過濾柱層析對銀杏種仁蛋白（Ginkgo biloba seed protein，GBSP）進行分離純化，得到一種抑菌蛋白GBSPⅠ-A。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測結(jié)果顯示，該蛋白呈單一條帶，其分子質(zhì)量約為42.80 kD；Superdex G-75柱層析結(jié)果顯示GBSPⅠ-A呈單一對稱峰，高效凝膠滲透色譜測定其分子質(zhì)量為39.32 kD；該蛋白對肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、戴爾有孢圓酵母及黑曲霉的最小抑菌濃度（minimum inhibitory conce ntration，MIC）分別為20、20、20、12 mg/mL。

銀杏種仁蛋白；分離純化；抑菌；分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)作為植物種子中主要的營養(yǎng)成分之一，除供給自身營養(yǎng)外，還可作為人類、動物、昆蟲以及微生物等的營養(yǎng)來源。因此，在種子萌發(fā)和發(fā)育過程中，失去種皮等物理屏障保護的貯藏組織非常容易遭受害蟲以及病原微生物的侵襲，此時植物依靠產(chǎn)生各種抗菌蛋白來抵御這種外來侵襲。這些植物源蛋白可以有效抑制外來細菌及真菌的生長，在植物防御系統(tǒng)中起著重要作用[1-2]。銀杏有裸子植物活化石之稱，自然界中的銀杏樹幾乎不會感染疾病，研究者們[3-5]圍繞這種特殊的植物進行了大量的研究，分別從銀杏葉中分離純化得到GAFF-1、GAFP及GAFP-1 3 種抗真菌幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，其分子質(zhì)量分別為26、4.244、30 kD；Shen Guoan等[6]從銀杏中克隆到一種茉莉酮酸酯依賴的防御素基因，Sawano等[7]從銀杏種仁中分離純化出一種分子質(zhì)量為9 kD的抗菌蛋白酶抑制劑，屬于植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白家族基因；Wang Hexiang等[8]從銀杏果仁中分離出一種具有抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性的新抗菌蛋白，牛衛(wèi)寧[9]、劉縉[2]等從銀杏種仁中分離出一種分子質(zhì)量約為13 kD的抑菌蛋白。諸如此類抗菌蛋白的研究對抗病作物育種、植物源農(nóng)藥的研發(fā)及新型食品防腐劑的研制具有重要意義。

離子交換層析（iron exchange chromatography）及凝膠層析（gel chromatography）是活性成分純化過程中最常采用的兩種柱層析技術(shù)。Huang Wen等[10]采用纖維素DE-52（G1、G2、G3、G4）結(jié)合DEAE-Sephadex A50從銀杏種仁中純化得到2 種抗氧化蛋白G4a、G4b，并對其抗衰老[11]、抗輻射[12]、抗腫瘤[13]及免疫調(diào)節(jié)[14-15]等生理活性進行了研究，黃虎等[5]采用幾丁質(zhì)親和層析結(jié)合Sephadex G-75凝膠過濾層析從銀杏葉中分離純化出一種抗菌蛋白。本實驗擬采用磷酸緩沖液提取銀杏種仁蛋白（Ginkgo biloba seed protein ，GBSP），并結(jié)合抑菌活性跟蹤，采用硫酸銨分級沉淀、纖維素DE-52陰離子柱層析及Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析等方法對銀杏種仁蛋白進行分離純化，得到具有抑菌活性的銀杏種仁純蛋白組分。此種方法純化所得蛋白為水溶性蛋白質(zhì)，有利于進行抑菌活性研究及實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏種仁脫脂粉：新鮮白果剝殼，去除紅色內(nèi)種皮，超低溫冷凍24 h后冷凍干燥72 h，粉碎并過40 目篩，得凍干粉，將其與石油醚混合脫色、脫脂，備用。

菌種：肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus）2種細菌由林產(chǎn)化工研究所實驗室提供；戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、黑曲霉（Aspergillus niger）2 種真菌由南京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程教研室提供。

透析袋（截留相對分子質(zhì)量6 000～13 000）；纖維素DE-52 美國Whatman公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-75 美國Pharmacia公司；低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Maker 北京Solarbio科技有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑 美國Sigma公司；PEG-20000、PEG-4000 美國Ameresco公司；蒽酮、硫酸、考馬斯亮藍G250、硫酸銨等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 35 紫外-可見分光光度計 美國PerkinEimer公司；2-16k臺式高速冷凍離心機 美國Sigma公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Mini電泳儀、電泳槽 美國Bio-Rad公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；BT1-100E 恒流泵、DBS-100-LCD全自動部分收集器 上海滬西分析儀器有限公司；玻璃中壓色譜柱（16 mm×500 mm） 上海琪特分析儀器有限公司；蛋白純化儀 瑞典Amersham Biosciences公司；Ultrahydrogel500水溶性GPC柱（6 mm×40 mm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定

銀杏種仁中總蛋白含量測定采用凱氏定氮法[16]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量測定采用Bradford染色法[17]。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算蛋白質(zhì)含量。其回歸方程為y=5.217 1x+0.003 8（R2=0.999 3）。按照下式計算蛋白質(zhì)提取率。

1.3.2 抑菌活性測定

1.3.2.1 菌懸液制備

細菌菌懸液制備：將供試細菌在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上活化。取活化好的菌種在無菌條件下，分別挑取一環(huán)放入含10 mL無菌水的離心管中，渦旋振蕩混勻，采用光電比濁法測定OD600nm，配制活菌數(shù)約1×108CFU/mL的細菌菌懸液，備用。

真菌菌懸液制備：將供試真菌在察氏培養(yǎng)基上活化。取滅菌竹簽，于真菌平板挑取真菌孢子或菌絲于含10 mL無菌水的離心管中，渦旋振蕩混勻，備用。

1.3.2.2 抑菌活性及最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

采用牛津杯法進行抑菌活性測定，倍半稀釋法進行MIC測定[18-19]。在無菌操作條件下，將0.1 mL菌懸液加于培養(yǎng)皿中，涂布均勻，制成帶菌平板。取3 個已滅菌牛津杯，均勻等距地置于平板表面，呈正三角形排列。將不同濃度銀杏種仁蛋白各0.2 mL用無菌移液槍加入牛津杯中，于（4±1）℃作4 h擴散處理，細菌在37 ℃培養(yǎng)24 h、真菌在28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察各培養(yǎng)皿菌落生長情況。幾乎無菌生長（抑菌圈直徑≥3.3 cm）的最低濃度為MIC。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，每組實驗重復(fù)3 次。同時參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦標(biāo)準(zhǔn)對抑菌效果進行定性判斷：抑菌圈直徑≥2.0 cm為極敏，1.5 cm≤抑菌圈直徑≤1.9 cm為高敏，1.0 cm≤抑菌圈直徑≤1.4 cm為中敏，0.6 cm≤抑菌圈直徑≤0.9 cm為低敏，抑菌圈直徑＜0.6 cm無抑菌作用，為耐藥。

1.3.3 銀杏種仁蛋白的提取

取脫脂銀杏種仁粉于具塞錐形瓶，與0.07 mol/L磷酸緩沖液（pH 8.0，含0.1 mol/L KCl、2 mmol/L EDTA）以1∶20（m/V）的料液比混合攪拌均勻，于4 ℃浸提14 h、10 000 r/min離心10 min，取上清液即為銀杏種仁蛋白粗提液。參照1.3.1節(jié)測定其中蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 銀杏種仁抑菌蛋白的分離純化

1.3.4.1 硫酸銨分級鹽析

取5 份50 mL粗蛋白提取液，向其中加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別為30%、40%、60%、80%、100%，4 ℃靜置6 h后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液并測定OD280nm，同時收集沉淀，參照1.3.2.2節(jié)進行抑菌活性測定，選擇合適的硫酸銨飽和度范圍。

1.3.4.2 透析除鹽

蛋白提取液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、離心棄上清液后，沉淀用少量磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）復(fù)溶，于4 ℃冰箱透析約12～18 h，BaCl2飽和溶液檢查透析是否完全[20]。透析后的蛋白液采用PEG20000濃縮、冷凍干燥即得銀杏種仁精制蛋白，4 ℃貯藏備用。

1.3.4.3 纖維素DE-52離子交換層析

將銀杏種仁精制蛋白用蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白液，離心、取上清作為上樣液。采用分段洗脫進行銀杏種仁精制蛋白的純化[21]。取10 mL蛋白液上樣于經(jīng)0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）平衡的纖維素DE-52離子柱，采用含0.1 mol/L NaCl、pH 7.0的0.02 mol/L PBS充分洗脫，流速0.5 mL/min，5 mL/管，并隔管檢測OD280nm；更換洗脫液離子濃度，依次采用含0.3、0.8 mol/L NaCl的PBS繼續(xù)洗脫，同上收集洗脫液并隔管檢測OD280nm；合并收集各洗脫峰。以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

將各洗脫峰的收集液分別采用PEG 20000濃縮、透析、冷凍干燥，得銀杏種仁蛋白各級分半純品。將其配制成20 mg/mL的溶液，參照1.3.2.2節(jié)進行抑菌活性測定，對活性較強的級分進行進一步純化。

1.3.4.4 Sephadex G-75凝膠過濾層析

取蛋白半純品級分，將其配制成10 mg/mL的上樣蛋白液，上樣量10 mL，用含0.01 mol/L NaCl的高純水作為流動相進行洗脫，1.3.4.3節(jié)操作并繪制洗脫曲線。

將各洗脫峰收集液分別采用PEG20000濃縮、透析、冷凍干燥，得各級分純品。將其配制成20 mg/mL的蛋白溶液，參照1.3.2.2節(jié)進行抑菌活性測定，并對活性較強的級分GBSPⅠ-A進行MIC測定。

1.3.5 銀杏種仁蛋白Superdex G-75柱層析

將純化所得蛋白GBSPⅠ-A配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL溶液，0.45 μm濾膜過濾后，進樣于Superdex G-75層析柱，進樣體積1.5 mL，高純水洗脫。蛋白純化系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)：流速0.5 mL/min，柱壓≤1.0 MPa，洗脫體積1.5 BV，280 nm跟蹤檢測。

1.3.6 銀杏種仁蛋白SDS-PAGE分析

采用分離膠12%、濃縮膠4%，電極緩沖液為0.05 mol/L、pH 8.3的Tris-Gly-SDS緩沖液（含0.1% SDS、0.384 mol/L Gly），上樣量20 μL。初始電壓80 V，待溴酚藍指示染料前沿進入分離膠后，電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后取下凝膠在考馬斯亮藍R250染色過夜，脫色3 h左右，至凝膠背景為無色透明，拍照并進行蛋白條帶及分子質(zhì)量分布特性分析。

1.3.7 銀杏種仁蛋白分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜進行蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定[21]。將純化所得抑菌蛋白配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，高純水為流動相，上樣量20 μL，洗脫流速0.8 mL/min，示差折光檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan’s檢驗，設(shè)置顯著水平分別為P＜0.05及P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨最佳飽和度的確定

由圖1可知，經(jīng)20%及40%飽和度的硫酸銨沉淀后，上清液中蛋白質(zhì)含量較高，且二者間無顯著差異（P＞0.05）。硫酸銨飽和度增大至60%時，上清液中蛋白含量較40%飽和度的蛋白含量顯著降低（P＜0.05），隨著硫酸銨飽和度進一步增加至80%，上清液中蛋白含量僅為1.78 mg/mL，說明在此硫酸銨飽和度條件下多數(shù)蛋白質(zhì)已被沉淀，當(dāng)飽和度增大至100%時，雖然上清液中蛋白質(zhì)含量更低，但與80%飽和度沉淀時差異不顯著（P＞0.05）。

實驗同時以K. pneumoniae、S. aureus、T. delbrueckii及A. niger為供試菌，將不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液進行抑菌活性分析，結(jié)果見表1。隨著硫酸銨飽和度增加，沉淀所得蛋白對各菌的抑菌直徑在飽和度20%～100%整體呈增大趨勢，硫酸銨飽和度為100%時，沉淀所得蛋白對各菌的抑菌直徑也較大，但與80%飽和度沉淀蛋白相比無顯著差異（P＞0.05），而與60%沉淀蛋白相比則差異顯著（P＜0.05），說明硫酸銨飽和度為80%時沉淀蛋白的抑菌效果最好，繼續(xù)增大硫酸銨飽和度意義不大；而硫酸銨飽和度為40%時，沉淀所得蛋白的抑菌直徑與40%飽和度以上各沉淀蛋白相比，除對S. aureus的抑菌直徑與其他蛋白無顯著差異外（P＞0.05），對其他3 種菌的抑菌直徑均顯著低于其他飽和度沉淀蛋白（P＜0.05），可能是40%飽和度下沉淀所得蛋白中抑菌蛋白含量不高，多數(shù)為雜蛋白而引起。因此，從抑菌活性及節(jié)約資源的角度考慮，實驗選用2 次分段沉淀法對銀杏種仁蛋白粗提液中的蛋白進行初步分離，即先于蛋白提取液中加入硫酸銨使其飽和度為40%，充分溶解后于4 ℃靜置1 h，5 000 r/min、4 ℃離心30 min，棄去沉淀，收集上清液；上清液再加入硫酸銨粉末，使其飽和度為80%，同上操作，離心收集沉淀，得到初步分離的銀杏種仁精制蛋白。采用40%～80%飽和度的硫酸銨2段沉淀分離，在縮小目標(biāo)蛋白范圍的同時，可去除部分雜質(zhì)。

表1 不同飽和度硫酸銨分級沉淀銀杏種仁蛋白的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of ammonium sulfate precipitation of different degrees of saturation

2.2 銀杏種仁蛋白纖維素 DE-52柱層析

圖2 銀杏種仁蛋白纖維素DE-52離子交換層析Fig.2 DEAE-cellulose DE-52 ion exchange chromatography

銀杏種仁蛋白是酸性蛋白（PI=4.62）[22]，因此可采用纖維素DE-52對其進行初步純化。將銀杏種仁粗蛋白樣品上樣于纖維素柱后，首先用含有0.1 mol/L NaCl、pH 7.0的0.02 mol/L PBS緩沖液液進行洗脫。由圖2可知，在此步純化過程中，得到1 個蛋白峰GBSPⅠ；更換洗脫液為含0.3 mol/L NaCl的PBS進行第2階段洗脫，得到第2種銀杏種仁蛋白半純化組分GBSPⅡ；進一步加大洗脫液的離子強度（含有0.8 mol/L NaCl的PBS）進行第2階段洗脫，得到第3種銀杏種仁蛋白半純化組分GBSPⅢ，OD280nm＜0.005后停止洗脫。

以K. pneumoniae、S. aureus、T. delbrueckii及A. niger為供試菌，將收集的各蛋白配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的蛋白液進行抑菌活性分析，結(jié)果見表2。

表2 銀杏種仁蛋白半純化組分GBSPⅠ、GBSPⅡ、GBSPⅢ的抑菌活性Table 2 Antimicrobial activities of GBSPⅠ, GBSPⅡ and GBSPⅢ

由表2可知，各純化蛋白對供試細菌及真菌均有一定的抑菌活性，其中GBSPⅠ的抑菌活性最強，其次為GBSPⅢ，二者間差異不顯著（P＞0.05），但其抑菌效果顯著優(yōu)于GBSPⅡ，GBSPⅡ?qū)Ω骶鷰缀蹙鶡o抑制作用。因此選擇GBSPⅢ及GBSPⅢ進行下一步凝膠色譜純化。

2.3 銀杏種仁蛋白Sephadex G-75凝膠過濾層析

選擇含0.01 mol/mL NaCl、pH 7.0的PBS緩沖液為洗脫液，采用Sephadex G-75凝膠過濾層析對抑菌活性較強的2 個吸收峰GBSPⅠ、GBSPⅢ分別進行進一步純化，洗脫曲線見圖3。GBSPⅠ、GBSPⅢ洗脫過程中均出現(xiàn)2 個明顯的蛋白吸收峰，分別命名為GBSPⅠ-A、GBSPⅠ-B及GBSPⅢ-A、GBSPⅢ-B。

圖3 銀杏種仁蛋白Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析Fig.3 Sephadex G-75 gel ?ltration chromatography

將上述純化所得GBSPⅠ-A、GBSPⅠ-B、GBSPⅢ-A和GBSPⅢ-B等4 種蛋白分別用無菌高純水配制成10 mg/mL溶液進行抑菌活性實驗，各蛋白對細菌及真菌的抑菌圈直徑見表3。

表3 銀杏種仁蛋白4 種純化組分的抑菌活性Table 3 Antimicrobial activities of GBSPⅠ-A, GBSPⅠ-B, GBSPⅢ-A and GBSPⅢ-B

由表3可知，4 種銀杏種仁蛋白對K. pneumoniae、S. aureus、T. delbrueckii及A. niger均有不同程度的抑菌效果。以抑菌圈直徑來判斷，GBSPⅠ-A及GBSPⅢ-A對K. pneumoniae均有較好的抑菌效果，其抑菌直徑分別為（2.91±0.03）、（2.05±0.01）cm，二者間無顯著差異（P＞0.05），但均顯著大于GBSPⅠ-B及GBSPⅢ-B（P＜0.05）；GBSPⅠ-A、GBSPⅢ-B對S. aureus也有明顯抑菌活性，GBSPⅢ-A對其也有明顯抑制作用；GBSPⅠ-A對T. delbrueckii及A. niger均有較強的抑菌效果，抑菌圈直徑分別達（3.03±0.01）、（3.12±0.02） cm；同時還可以看出各蛋白對A. niger的抑菌效果均較好。綜上，可以得出GBSPⅠ-A對4種供試菌的抑菌效果最好，因此選擇對GBSPⅠ-A進行MIC實驗。

2.4 銀杏種仁蛋白MIC測定

表4 銀杏種仁蛋白GBSPⅠ-A的MICTable 4 MICs of GBSPⅠ-A

用無菌高純水將GBSPⅠ-A配制成一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液，采用倍半稀釋法將其依次稀釋成梯度質(zhì)量濃度溶液，分別進行抑菌活性實驗，測定GBSPⅠ-A對各供試菌的MIC，抑菌直徑測定及抑菌效果分別見表4。GBSPⅠ-A對供試細菌及真菌均有一定的抑菌活性。其中，對A. niger的抑菌活性最強，其MIC為12 mg/mL，對其他3 種供試菌的MIC均為20 mg/mL。從抑菌直徑看，GBSPⅠ-A對K. pneumoniae及T. delbrueckii的抑菌直徑隨質(zhì)量濃度變化差異不顯著，而對S. aureus、A. niger的抑菌直徑隨著質(zhì)量濃度的梯度變化差異比較明顯。

2.5 銀杏種仁蛋白純化得率

表5 銀杏種仁抑菌蛋白分離純化步驟及其得率Table 5 Purification steps of GBSP

通過測定經(jīng)每步純化后所得抑菌蛋白的質(zhì)量，計算蛋白得率，由表5可知，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到4 900 mg初步純化蛋白，之后經(jīng)過纖維素DE-52及Sehpadex G-75依次純化后，最終得到1 113 mg銀杏種仁蛋白GBSPⅠ-A，其得率為22.70%。

2.6 銀杏種仁蛋白SDS-PAGE分析

圖4 銀杏種仁蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE Electropherogram of GBSP

由圖4可知，經(jīng)硫酸銨沉淀所得樣品中蛋白條帶較多、較雜，有10多條蛋白條帶；經(jīng)纖維素DE-52離子交換層析及Sephadex G-75凝膠過濾層析后，電泳顯示條帶數(shù)越來越少，所得抑菌活性最強的蛋白峰GBSP?-A的SDS-PAGE電泳圖譜顯示為單一條帶，說明樣品蛋白達到電泳純，其分子質(zhì)量約為42.80 kD。

2.7 銀杏種仁蛋白GBSP?-A Superdex G-75分析

對純化所得抑菌活性最強的蛋白峰GBSPⅠ-A用高純水配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，離心取上清液后上樣Superdex G-75層析柱，結(jié)果如圖5所示，可以看出GBSPⅠ-A為單一對稱峰，因此認(rèn)為GBSPⅠ-A為純蛋白。

圖5 GBSPⅠ-A Superdex G-75分子篩凝膠過濾層析Fig.5 Superdex G-75 gel ?ltration chromatography of GBSPⅠ-A

2.8 銀杏種仁蛋白GBSPⅠ-A分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法對GBSPⅠ-A進行分子質(zhì)量測定，通過對標(biāo)準(zhǔn)品的測定得到分子質(zhì)量（M，kD）與保留時間（t，min）的標(biāo)準(zhǔn)方程為lgM=4.49×10－1t－2.35×10－2t，（R2=0.999 8），由圖6可知，該蛋白顯示單一對稱峰，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方程計算其分子質(zhì)量為39.32 kD，與SDS-PAGE所得表觀分子質(zhì)量接近。

圖6 GBSPⅠ-A高效凝膠滲透色譜圖Fig.6 HPGPC Chromatogram of GBSPⅠ-A

3 結(jié) 論

以K. pneumoniae、S. aureus 2種細菌及T. delbrueckii、A. niger 2 種真菌為供試菌，對銀杏種仁蛋白的純化過程進行抑菌活性跟蹤，確定采用40%～80%硫酸銨分級沉淀法對銀杏種仁蛋白提取液中的蛋白進行初步分離，并結(jié)合纖維素DE-52陰離子交換柱層析及Sephadex G-75凝膠過濾柱層析對蛋白進行進一步純化，得到1 個抑菌活性最強的蛋白峰GBSPⅠ-A。GBSPⅠ-A對4 種菌的MIC分別為20、20、20、12 mg/mL。該蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示為單一條帶，說明達到電泳純，其分子質(zhì)量約為42.80 kD；Superdex G-75柱層析結(jié)果顯示單一對稱峰，高效液相凝膠過濾色譜檢測其分子質(zhì)量為39.32 kD。

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Purification and Antimicrobial Activity of Protein from Ginkgo biloba Seed Kernels

WU Hai-xia1,2, WU Cai-e1,3,*, FAN Gong-jian1,3, LI Ting-ting1,3, YING Rui-feng1,3, HUA Jing1
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Department of Life Science, Yuncheng University, Yuncheng 044000, China; 3. College of Light Industry Science and Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

An antimicrobial protein was isolated and purified from the seed kernels of Ginkgo biloba and its antimicrobial activity was analyzed. Ginkgo biloba seed protein (GBSP) was purified by ammonium sulfate precipitation, dialysis, DEAE-cellulose DE52 ion-exchange and Sephadex G-75 gel filtration through bioassay-guided method. A protein fraction named GBSPⅠ-A possessing antimicrobial activity, was obtained. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis suggested that the protein was homogeneous and its apparent molecular mass was 42.80 kD. The results of chromatographic identification by Superdex G-75 and HPGPC showed a single and symmetrical peak with a molecular weight of 39.32 kD. The protein exhibited potent antimicrobial activity against K. pneumoniae, S. aureus,T. delbrueckii, and A. niger with minimum inhibitory concentrations (MIC) of 20, 20, 20, and 12 mg/mL, respectively. This study could provide a theoretical basis for the discovery of a new antibacterial protein and the development of food preservatives.

Ginkgo biloba seed protein (GBSP); isolation and purification; antimicrobial activity; molecular weight

S664.3；TS201.3

A

1002-6630（2014）13-0108-06

10.7506/spkx1002-6630-201413020

2014-05-28

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（CXZZ12_0544）；國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004015）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（PAPD）

吳海霞（1980—），女，講師，博士，研究方向為植物活性成分分離純化及構(gòu)效關(guān)系。E-mail：whxviolet@163.com

*通信作者：吳彩娥（1963—），女，教授，博士，研究方向為植物活性成分分離純化及構(gòu)效關(guān)系。E-mail：sxwucaie@163.com