HPLC-q/LTQ-MS法測定肉及肉制品中10 種β-受體激動劑

張 旖，趙善貞，曲 栗，曹 晨，時逸吟，伊雄海

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

HPLC-q/LTQ-MS法測定肉及肉制品中10 種β-受體激動劑

張 旖，趙善貞*，曲 栗，曹 晨，時逸吟，伊雄海

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

建立基質(zhì)分散固相萃取-高效液相色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法快速測定肉和肉制品中的克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、妥布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西馬特羅、非諾特羅以及苯乙醇胺A 10 種β-受體激動劑。豬肉、腸衣和午餐肉中的β-受體激動劑經(jīng)乙腈提取后，采用基質(zhì)分散固相萃取凈化，內(nèi)標法定量。方法按照多反應監(jiān)測、信息相關采集、增強離子掃描，結(jié)合10 種β-受體激動劑標準的子離子譜庫檢索進行分析，可對試樣中10 種β-受體激動劑同時進行定性、定量測定。結(jié)果表明，克侖特羅在0.05～0.5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其余9 種藥物殘留在0.5～5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r2）均大于0.99?？藖鎏亓_定量限為0.05 μg/kg，其余9 種藥物定量限為0.5 μg/kg。10 種β-受體激動劑在豬肉、腸衣和午餐肉中平均回收率分別在85.6%～118.4%、85.6%～119.2%、80.4%～118.4%之間（n=6），相對標準偏差在1.47%～14.4%、2.45%～15.4%、1.04%～12.5%之間（n=6）。方法可對豬肉、腸衣、午餐肉等肉和肉制品中10 種β-受體激動劑藥物的定性同時進行定量測定。

β-受體激動劑；基質(zhì)分散固相萃??；高效液相色譜-四極桿-線性離子阱質(zhì)譜；肉與肉制品

克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、妥布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西馬特羅、非諾特羅以及苯乙醇胺A等均屬于β-受體激動劑，能與腎上腺素受體結(jié)合，臨床上主要用于治療人的哮喘、支氣管痙攣等。豬食用該類物質(zhì)后在代謝過程中促進蛋白質(zhì)合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，提高豬肉的瘦肉率。但是人食用含有上述物質(zhì)的畜產(chǎn)品常會引起心律失常、心慌、心悸、甲狀腺機能亢進等中毒癥狀。除萊克多巴胺以外，歐盟、美國等一些發(fā)達國家紛紛禁止使用上述獸藥，我國早在2003年已經(jīng)明確將該類藥物列入農(nóng)業(yè)部公告第176號《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》[1]。其中苯乙醇胺A，又稱克侖巴胺，是我國首先發(fā)現(xiàn)的一種新型“瘦肉精”，2010年12月列入農(nóng)業(yè)部公告第1519號《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》[2]。

在β-受體激動劑監(jiān)督檢測過程中，唾液[3]、尿液[4]、血液[5]、動物組織[6]、毛發(fā)[7]等都可作為檢測對象。對于β-受體激動劑類物質(zhì)的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、高效液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-11]和液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法[12-17]等，其中酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法現(xiàn)在多用于樣品中β-受體激動劑的快速篩查，液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法是目前常用的確證方法。

現(xiàn)有上述報道中，對于β-受體激動劑的前處理多采用固相萃取柱凈化，較為復雜，且尚未有采用四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀對上述藥物同時定性、定量測定的報道。高效液相色譜-四極桿-線性離子阱質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry，HPLC-q/LTQ-MS）法檢測具有從多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）、信息相關采集（information dependent acquisition，IDA）、增強子離子掃描（enhanced product ion scan，EPI）、譜庫檢索的獨有檢測模式，能夠?qū)崿F(xiàn)對未知化合物同時定性定量的目的[18-20]。本方法前處理操作簡便、精密度和準確度較高，分析時間短、凈化效果好，可對豬肉、腸衣和午餐肉等動物源性食品中的10 種β-受體激動劑在定性測定的同時進行定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸（色譜純0.45 μm有機相濾膜） 德國CNW公司；QuCHERs粉末包括：丙基乙二胺（primarysecondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、C18、MgSO4粉末 上海安譜科學儀器有限公司；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶美國Sigma公司；水為去離子水。

標準品：克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、妥布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西馬特羅、非諾特羅以及苯乙醇胺A；內(nèi)標物質(zhì)：D9-克侖特羅、D3-沙丁胺醇、D6-萊克多巴胺、D5-苯乙醇胺A、D3-特步他林（純度均大于98%） 德國DR.E公司。

標準儲備液的配制：稱取適量的上述標準品，分別用甲醇溶解定容至100 mL，溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，－18 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

工作溶液的配制：準確移取適量上述標準工作溶液以及其內(nèi)標標準工作溶液，用試劑空白溶液配成適當質(zhì)量濃度的標準曲線，其中克侖特羅質(zhì)量濃度范圍為0.05～0.5 ng/mL；其余9 種藥物質(zhì)量濃度范圍為0.5～5 ng/mL，臨用時現(xiàn)配。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀 日本資生堂公司；API4000 Q-Trap四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀（配備電噴霧電離（elaectrospray ionization，ESI）源） 美國AB Sciex公司；超聲波發(fā)生器 德國Elma公司；渦旋混勻器 美國SI公司；離心機 美國Beckman公司；分析天平（感量0.000 1 g和0.01 g） 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取2 g（精確至0.01 g）豬肉、腸衣、午餐肉試樣均質(zhì)勻漿后置于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙酸銨緩沖溶液，50 μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶，37 ℃酶解過夜。酶解后的試樣中加入5 種β-受體激動劑內(nèi)標溶液，15 mL含體積分數(shù)0.1%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清，重復提取一次，合并上清液。將100 mg PSA、25 mg GCB、150 mg C18、500 mg MgSO4全部加入上述提取液中，渦旋混勻5 min，取有機相，40 ℃減壓蒸發(fā)至近干。1 mL乙腈-水（V∶V）溶液溶解殘渣，過0.45 μm有機相濾膜，HPLC-q/LTQ-MS測定。

1.3.2 HPLC條件

色譜柱：Agilent XDB C18（4.6 mm×5.0 mm，1.8 μm）；流動相：A：含5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸的水溶液，B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0 min，95%A；2 min，50%A；3 min，1%A；9.5 min，1%A；10.0 min，95A%；15 min，95A%；流速：400 μL/min；進樣量：20 μL；柱溫：常溫。

1.3.3 MS條件

電噴霧電壓4 500 V；霧化氣壓力50 psi；氣簾氣壓力30 psi；輔助氣壓力45 psi；離子源溫度450 ℃。

當MRM信號域值大于IDA設定的1 000 cps時，同時啟動線性條件：在上述質(zhì)譜條件下增加IDA監(jiān)測模式，監(jiān)測響應值超過1 000最強的一個離子。建立增強離子掃描模式，掃描分子質(zhì)量為50～400 D的離子，掃描速率為4 000 D/s。EPI電壓參數(shù)：去簇電壓（declustering potential，DP）100 V；碰撞氣能量（collision energy，CE）45 V；擴展碰撞氣能量（collision energy spared，CES）15 V。

1.3.4 LC-MS-MS譜庫設置

分別用低、中、高3 種碰撞能量（30、45、60 eV）對10 種β-受體激動劑標準品進行EPI掃描，并用ACESS數(shù)據(jù)庫編寫10 種β-受體激動劑的液相色譜-串聯(lián)離子阱的二級譜庫，包括分子式、相對分子質(zhì)量、CAS號、化學名及結(jié)構(gòu)圖等。

1.3.5 檢測模式

MRM-IDA-EPI-譜庫檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

采用β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶酶解樣品，將動物組織中蛋白質(zhì)消解，使某些易和蛋白結(jié)合的待測物從細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)下游離出來。采用0.2 mol/L的乙酸銨作為酶解緩沖液，使得在之后的提取步驟中，上層的乙腈層和下層水層由于鹽析作用而較好地分層，有利于提取之后的濃縮。10 種β-受體激動劑類藥物極性較強，采用乙腈溶液就可以較好地將這些藥物殘留提取出來，此外乙腈溶液有利于肉制品中蛋白質(zhì)的沉淀，比較含體積分數(shù)1%乙酸-乙腈溶液和含體積分數(shù)1‰甲酸-乙腈溶液的提取效率，最終采取含體積分數(shù)1‰甲酸-乙腈溶液作為提取液。肉制品中脂肪含量較高，150 mg的C18粉末即可去除試樣中的大部分脂肪。用25 mg GCB粉末除去肉組織中存在的部分色素，100 mg PSA粉末除去有機酸等雜質(zhì)[21]，降低基質(zhì)效應對檢測結(jié)果的干擾。由于PSA粉末的效果取決于樣品中的含水量，采用QuCHERs粉末凈化過程中，加入無水硫酸鎂，除去肉與肉制品中殘余水分，有利于PSA粉末的凈化。

2.2 HPLC和MS測定條件的比較

比較Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）和Thermo C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）對10 種β-受體激動劑的分離效果。結(jié)果表明，XDB-C18柱對上述藥物的分離效果和峰形均較好，靈敏度較高。

采用質(zhì)量濃度5 μg/mL上述10 種β-受體激動劑以及5 種內(nèi)標標準溶液分別測定。在正離子模式下，進行母離子全掃描，確定分子離子，并優(yōu)化DP、CE等參數(shù)條件，以達到最佳靈敏度（表1）。確定2 個子離子作為定性離子，并選擇其中之一作為定量離子。

表1 10種β-受體激動劑及其內(nèi)標物的質(zhì)譜條件和保留時間Table1 Optimized spectrometric parameters and retention times of 10 kinds of agonists and their internal standards

2.3 EPI模式的特征

和普通的三重四極桿質(zhì)譜儀相比，線性離子阱質(zhì)譜能夠阱集碎片離子，通過EPI模式能夠提供高靈敏度的檢測方式，繼而通過譜庫檢索，達到同時定性定量的目的。采用MRM-IDA-EPI-譜庫檢索的多步模式，首先利用Q-Trap的線性離子阱功能，從MRM模式獲得各個化合物的保留時間、峰高、峰面積、離子比率等信息，再通過EPI掃描獲得二級質(zhì)譜圖，和已經(jīng)建立好的譜庫進行比較，可獲得其相似度和反相似度的值。

豬肉加標樣品中噴布特羅和標準溶液圖譜中噴布特洛的相似度值（84.381）和反相似度（75.078）值均較高，同時，結(jié)合化合物的保留時間4.17 min輔助定性分析，在不需要對該樣品重新進樣條件下，實現(xiàn)對樣品中噴布特羅的快速確證，簡化定性分析流程（圖1）。

圖1 2 種模式（MRM）和（IDA）下，豬肉基質(zhì)加標（0.5 g/kg）樣品中妥布特羅的測定及EPI譜庫檢索Fig.1 Determination of tulobuterol in spiked pork (0.5 μg/kg) under both operation modes (MRM) and (IDA), and enhanced product ion (EPI) library search

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限

在本方法所確定的實驗條件下，分別用溶劑空白配制標準溶液，在選定的條件下進行測定。克侖特羅的線性范圍在0.05～0.5 ng/mL內(nèi)、其余9 種β-受體激動劑的線性范圍在0.5～5 ng/mL內(nèi)，標準峰面積與內(nèi)標峰面積的比值Y與對應的質(zhì)量濃度比值X（μg/L）呈現(xiàn)良好線性關系，相關系數(shù)（r2）均大于0.99。在基質(zhì)空白溶液中添加目標化合物，以特征離子色譜峰的信噪比RSN＞3確定為方法檢出限，RSN＞10確定為方法定量限，克侖特羅的檢出限為0.025 μg/kg，定量限為0.05 μg/kg；其余9 種β-受體激動劑的檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg（表2）。

表2 10 種-受體激動劑的線性方程和相關系數(shù)Table2 Regression equations and correlation coefficients (r2) of 10 kinds of -agonists

2.4.2 方法回收率及精密度

表3 100 種β-受體激動劑添加回收率范圍及精密度（n=6）Table3 Recoveriges and RSDs of 10 kinds ofβ-agonissttss (n=6)

圖2 豬肉中添加0.05 μg/kg克侖特羅、0.5 μg/kg其余9 種β-受體激動劑的選擇離子色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of pork spiked with 0.05 μg/kg clenbuterol and 0.5 μg/kg 9 other kinds of β-agonist standards

在本方法所確定的實驗條件下，在豬肉、腸衣、午餐肉3 個基質(zhì)中分別以l、2、4 倍執(zhí)行限量水平進行添加，考察10 種β-受體激動劑的回收率和精密度，每個進行6 次重復實驗。表3、圖2結(jié)果表明，10 種藥物在3 個基質(zhì)中的平均回收率分別在85.6%～118.4%、85.6%～119.2%、80.4%～118.4%之間，相對標準偏差在1.47%～14.4%、2.45%～15.4%、1.04%～12.5%之間，符合殘留檢測的要求。

2.5 實際樣品測定

以本方法對豬肉、腸衣、午餐肉的12 批實際樣品進行測定，在兩份豬肉樣品中發(fā)現(xiàn)萊克多巴胺殘留，殘留量分別為2.14、8.47 μg/kg。

3 結(jié) 論

本方法前處理操作簡便、精密度和準確度較高，分析時間短、凈化效果好，可對豬肉、腸衣和午餐肉等動物源性食品中的10 種β-受體激動劑在定性測定的同時進行定量測定。

[1] 農(nóng)業(yè)部第176號公告. 禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)[S].

[2] 農(nóng)業(yè)部第1519號公. 禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)[S].

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Determination of 10 Kinds of β-Agoinsts in Meat and Meat Products by Matrix Solid-phase Dispersion-High Performance Liquid Chromatography Tandem Quadrupole Linear Ion Trap Mass Spectrometry

ZHANG Yi, ZHAO Shan-zhen*, QU Li, CAO Chen, SHI Yi-yin, YI Xiong-hai
(Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

A method based on matrix solid-phase dispersion-high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-q/LTQ-MS) for the determination of 10 kinds of β-agoinsts in meat and meat products was presented. Clenbuterol, salbutamol, ractopamine, tulobuterol, terbutaline, clorprenaline, penbutolol, cimaterol and fenoterol were extracted with acetonitrile, followed by a further clean-up procedure using QuEChERS method. A multiple reaction monitoring (MRM) as survey scan and an enhanced product ion (EPI) scan as dependent scan were performed in an information dependent acquisition (IDA) experiment. The identification of the compounds was carried out by library search with a precursor ion MS-MS library based on EPI spectra at three different collision energies in a positive mode. The results showed that clenbuterol was in the range of 0.05-0.5 ng/mL, and 9 other kinds of β-agoinsts residues were in the range of 0.5-5 ng/mL with correlation coefficients (r2) higher than 0.99. The limit of quantification was 0.05 μg/kg for clenbuterol and 0.5 μg/kg for 9 other kinds of β-agoinsts. The recoveries of spiked standards in pork, casing and luncheon meat ranged from 85.6% to118.4%, 85.6% to119.2%, and 80.4% to 118.4%, with relative standard deviation (RSD) of 1.47%-14.4%, 2.45%-15.4%, and 1.04%-12.5% (n = 6), respectively. This method can be used for simultaneous analysis of 10 kinds of β-agonists in meat and meat products.

β-agoinsts; matrix solid-phase dispersion; high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-q/LTQ-MS); me at and meat products

O657

A

1002-6630（2014）20-0202-06

10.7506/spkx1002-6630-201420040

2014-01-23

上海出入境檢驗檢疫局科研項目（HK014-2014；HK008-2014）；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201110019-04；201310140-02）；國家重大科學儀器設備開發(fā)專項（2013YQ15055705）

張旖（1987—），助理工程師，學士，研究方向為食品安全。E-mail：693532054@qq.com

*通信作者：趙善貞（1983—），工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：zhaosz@shciq.gov.cn