基于可視化抗體宏陣列技術的出血性大腸桿菌O157∶H7定量檢測

李浩林，劉 箐，劉 芳，董慶利，邱 實，楊玉萍，郭慧琴，韓舜愈

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730000；4.上?；墼派锟萍加邢薰荆虾?200437）

基于可視化抗體宏陣列技術的出血性大腸桿菌O157∶H7定量檢測

李浩林1,2，劉 箐2，劉 芳3，董慶利2，邱 實2，楊玉萍2，郭慧琴4，韓舜愈1,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730000；4.上海慧耘生物科技有限公司，上海 200437）

目的：探索建立一種新的出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）的快速定量檢測技術。方法：以硝酸纖維素膜為基片，用生物芯片點樣儀制作抗體宏陣列，采用“雙抗夾心”原理，對出血性大腸桿菌O157∶H7進行定量檢測研究。結(jié)果：本方法對出血性大腸桿菌O157∶H7的檢出限為3.4×105CFU/mL，在105～107CFU/mL細菌濃度范圍內(nèi)，宏陣列的灰度值與細菌濃度之間有較好的線性關系。該方法可在2.5 h內(nèi)同步檢測多個樣品中出血性大腸桿菌O157∶H7的濃度。結(jié)論：通過用標準菌株、模擬帶菌等研究顯示，用宏陣列技術快速定量檢測出血性大腸桿菌O157∶H7，結(jié)果肉眼可見，穩(wěn)定準確，同時操作簡便、成本低廉、無需大型設備，制作好的抗體宏陣列可用于快速評估食品中出血性大腸桿菌O157∶H7的污染狀況，尤其適合于基層實驗室進行快速高通量樣品篩查。

出血性大腸桿菌O157∶H7；抗體宏陣列；可視化；定量檢測

出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）是一種人畜共患病病菌，該菌對酸、低溫等有較強的抗逆性，且致病性較強，可通過食品、人畜糞便等造成大規(guī)模爆發(fā)流行；該菌感染后引起嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等癥狀，嚴重時伴有并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征、出血性腸炎等[1]。大腸桿菌O157∶H7型是引起出血性腸炎最常見的致病菌之一，1982年，美國首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7感染的疫情，是由牛肉漢堡傳播，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)是牛肉污染引起；2005年，瑞典首次暴發(fā)大腸桿菌O157∶H7疫情，由污染的萵苣引發(fā)[2]。

常見的致病菌檢測方法有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法、酶聯(lián)免疫分析、聚合酶鏈式反應[3]等，也有近幾年出現(xiàn)的生物傳感器、免疫層析、電化學免疫法、微流控芯片[4-8]等新型檢測技術，但除去傳統(tǒng)平板計數(shù)方法以外，以上新型方法只能進行定性檢測，且均有操作復雜、必須配合較高級設備、檢測成本過高等問題。GB 29921—2013《食品中致病菌限量》已于2013年12月26日頒布，并于2014年7月1日實施，此會對微生物定量檢測技術提出新要求。傳統(tǒng)的定量檢測方法如平板菌落計數(shù)法，耗時費力，無法適應大規(guī)模篩查檢測的需要。近年來諸多學者對細菌的定量檢測進行了研究探索，如結(jié)合實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術可以實現(xiàn)對細菌的快速定量檢測[9-11]，但該方法在對實際樣品的檢測中，由于受到PCR檢測模板體系較少等限制，不僅會造成較高的漏檢率，且操作相對復雜，成本較高，同時需要昂貴儀器，難以普及到基層實驗室。本實驗室在多年可視化蛋白芯片研究的基礎上，采用了可視化抗體宏陣列、酶標抗體化學顯色等技術，研制適合新標準要求的定量檢測技術，以期為未來的致病菌定量檢測研發(fā)實用技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖1 可視化抗體宏陣列點樣設計Fig.1 Visual antibody macroarray spot design

表1 實驗所用標準菌株Table1 Standard strains used in this study

出血性大腸桿菌O157∶H7多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體以及各標準菌株（表1） 上?；墼派锟萍加邢薰?；硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane（NC膜），孔徑0.22 μm） 美國Pall公司；增強型HRP-DAB底物顯色液 北京天根生化科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限公司。

1.2 儀器與設備

AD6010生物芯片點樣儀 美國Bio-Dot公司；D90數(shù)碼相機、AF-S VR Micro-Nikkor 105mm f/2.8G IF-ED微距鏡頭 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 宏陣列制作

用含有20%甘油的碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）作為點樣液稀釋大腸桿菌多克隆抗體（一抗）至工作質(zhì)量濃度200 μg/mL，作為捕獲抗體，用生物芯片點樣儀噴點在1 cm2的NC膜表面，每點80 nL，樣點之間相距2 mm。點樣設計如圖1所示，第1行為捕獲抗體。第2行為純點樣液，作為陰性控制，以確保點樣液未受污染，避免假陽性的出現(xiàn)；第3行為羊抗豬IgG-HRP，作為陽性控制，以確保顯色液的有效性[12]。點樣完成后將基片置于4 ℃過夜備用。

1.3.2 宏陣列檢測

封閉：用含有3%脫脂奶粉的磷酸緩沖液洗液（phosphate buffered saline tween 20，PBST）封閉陣列基片，同時輕微振蕩；洗滌：吸除封閉液，PBST輕微振蕩洗滌3 次；免疫反應：用菌液與抗體陣列反應，同時輕微振蕩，之后吸除菌液，洗滌；加入二抗：將稀釋600 倍的HRP標記大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體與宏陣列基片反應，同時輕微振蕩，之后吸除二抗，洗滌；顯色：加入二氨基聯(lián)苯胺（diamino aniline blue，DAB）顯色液，避光顯色，同時輕微振蕩，之后吸除顯色液，并加入雙蒸水終止反應；最后用鑷子從反應槽中取出反應完成的宏陣列基片，平鋪于濾紙上避光陰干。

1.3.3 陣列靈敏度實驗

用滅菌生理鹽水依次1 0 倍梯度稀釋單菌落培養(yǎng)的標準菌株純菌液，并倒平板計數(shù)，濃度為3.4×100～3.4×108CFU/mL，生理鹽水作為空白對照，用制作好的宏陣列基片進行檢測。

1.3.4 標準曲線的擬合

平板計數(shù)后，用生理鹽水10 倍稀釋純菌液至3.4×107CFU/mL，再將該濃度菌液用生理鹽水依次連續(xù)對半稀釋成不同濃度的菌液作為標準液，選擇3.4×107、1.7×107、8.5×106、4.25×106、2.125×106、1.062 5×106、5.312 5×105CFU/mL作為標準曲線細菌濃度，用制作好的宏陣列基片進行實驗。之后用數(shù)碼相機拍照，此過程是在暗室中完成的，其間相機的各參數(shù)設置均保持一致，并且將相機固定在特定高度的支架之上，然后由上向下進行拍照，以確保不同的宏陣列結(jié)果均取自于相同的光源、光強以及成像距離。成像過程中的相機參數(shù)設置為：感光度3 200，快門速度1/30，閃光指數(shù)17，成像距離固定的58.5 cm。最后，照片不做任何處理，用Photoshop圖像軟件在灰度模式下對照片中的檢測樣點進行灰度分析，用Excel軟件制作標準曲線。

1.3.5 模擬增菌實驗

按照GB/T 4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》中的規(guī)定，對超市購買的食品面包、果凍、牛奶進行前處理，在處理好的250 mL樣品中加入事先培養(yǎng)并且稀釋106倍的標準菌液1 mL，經(jīng)計數(shù)為380 個/mL，然后于37 ℃進行增菌培養(yǎng)，分別于2、4、6、8、10、12、14、16 h后進行宏陣列檢測，并同步用大腸桿菌O157∶H7顯色培養(yǎng)基涂布平板計數(shù)，之后分析平板計數(shù)結(jié)果與標準曲線推算結(jié)果的符合程度。

1.3.6 特異性檢測

用生理鹽水分別將金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等常見食源性致病菌制備成107CFU/mL菌懸液，用制作好的宏陣列進行檢測，驗證其特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度實驗

本研究中所有用到的信號值，都是用軟件分析各個檢測樣點的單點灰度峰值，并換算成信號值，最終的信號值為4 個平行信號值的平均值（灰度值范圍為0～255，顏色越深，灰度值越低，本研究將所有檢測樣點信號值定義為：信號值=255－灰度值）。如圖2a所示，3 次重復實驗結(jié)果，隨著菌液濃度依次降低，信號值也依次減弱，菌液濃度在3.4×104CFU/mL以下時，均不能檢出，可以看到，本抗體宏陣列的檢測靈敏度為3.4×105CFU/mL。通過軟件分析各檢測樣點灰度值，制作如圖2b所示直方圖，可以直觀地看到，3.4×108～3.4×105CFU/mL菌液濃度之下，其平均信號值依次為120.5、129.75、114.75、60，其中3.4×107CFU/mL菌液濃度時檢測信號值最強，而在3.4×108CFU/mL菌液濃度時，檢測信號值為120.5，弱于3.4×107CFU/mL菌液濃度時的信號值129.75，并且從107CFU/mL菌液濃度開始，濃度越低，檢測信號值越弱，此平均數(shù)值來自相同的3 次重復實驗。表2為4 個菌液濃度條件下檢測樣點信號值的變異系數(shù)。

圖2 靈敏度實驗Fig.2 Sensitivity of the method

表2 各菌液濃度條件下信號值的變異系數(shù)Table2 Coefficient of variations of signal values for different bacterial concentrations

2.2 標準曲線擬合

標準曲線陣列的實驗結(jié)果如圖3a所示，A、B、C為相同的3 次重復實驗。以檢測樣點平均信號值為縱坐標，將各梯度標準菌液的濃度值以10為底取其對數(shù)作為橫坐標，分別對應擬合b、c、d 3 條標準曲線，如圖3b、c、d所示。

由圖3可見，各檢測樣點的信號隨著標準菌液濃度的增加而逐漸增強，擬合的3 條標準曲線也有著相似的增長趨勢，經(jīng)過對各檢測樣點的灰度值進行分析，各菌液濃度條件下3 組平均信號值的變異系數(shù)如表3所示，其中，4.25×106CFU/mL菌液濃度條件下的變異系數(shù)最小，為0.37%，2.125×106CFU/mL菌液濃度條件下的變異系數(shù)最大，為1.03%，但后者仍然遠小于一般酶聯(lián)免疫分析實驗所要求的5%[13]，因此，標準曲線的穩(wěn)定性和重復性較強，由此得到較為理想的標準曲線。

圖3 標準曲線擬合實驗Fig.3 Standard curves

表3 各菌液濃度條件下3 組平均信號值的變異系數(shù)Table3 Coefficients of variations for three average signal values

2.3 模擬增菌定量檢測

如圖4a、c、e所示，抗體陣列對果凍、面包、牛奶樣品在增菌8 h后即可檢出，但10 h之后的檢測樣點信號值反而隨抗原濃度的增大而降低，3個樣品在不同增菌時間的檢測平均信號強度如圖4b、d、f所示。

圖4 模擬增菌實驗Fig.4 Detection of simulated enrichment culture

由圖4可見，果凍樣品在增菌8 h時檢測信號值最強，達到了90.25，隨后增菌10 h的檢測信號有所減弱，為85.5，而之后再增菌培養(yǎng)12、14、16 h后的檢測信號強度相比于8 h和10 h進一步減弱，但三者之間無明顯差異。如圖4d所示，面包樣品增菌8 h的檢測信號強度為79.75，弱于增菌10 h的107.75，隨后的3 個增菌時間段的檢測結(jié)果依次減弱，分別為97.5、94.75和94。如圖4f所示，牛奶樣品增菌8 h的檢測強度為91，增菌10 h的檢測強度為97.75，增菌12、14、16 h的檢測強度依次為90、92.5、89.75，三者之間無明顯差異。

對3 個樣品增菌8 h和10 h的檢測樣點進行灰度值分析，并將信號值分別代入圖3中的3 條標準曲線中，推算出相應濃度，然后與同步平板計數(shù)的結(jié)果進行比較，如表4及圖5所示。增菌8 h和10 h的細菌數(shù)目在3 條標準曲線的線性范圍之內(nèi)，分析其各個檢測樣點的灰度值，換算成信號值并取平均值后代入圖3b、c、d 3 條標準曲線中，得到相應的推算數(shù)目，如表4所示，在同一增菌時間范圍內(nèi)，3 條標準曲線推算所得到的3 個結(jié)果之間差異很小，可以忽略不計，因此可以確定標準曲線的穩(wěn)定性。

表4 實際樣品檢測中涂布平板計數(shù)與標準曲線推算結(jié)果的比較Table4 Comparison of spread plate counts and results calculated from the standard curves for real samples

另外，如表4所示，對涂布平板計數(shù)結(jié)果與標準曲線推算數(shù)結(jié)果進行比較，面包樣品增菌8、10 h以及牛奶樣品增菌8 h的推算結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果在同一數(shù)量級，而果凍樣品增菌8、10 h以及牛奶樣品增菌10 h的推算結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果相差一個數(shù)量級；分析有兩部分原因，一方面，用作標準曲線的抗體宏陣列在實驗過程中，各溶液、緩沖液組分單一、穩(wěn)定，對抗原抗體特異性結(jié)合影響較小，而實際樣品中成分復雜，對抗原抗體的特異性結(jié)合有較大影響，即“基質(zhì)效應”[14]，因而在顯色完成后，標準曲線與實際樣品的信號值會有差異，從而影響推算結(jié)果；另一方面，在增菌同步涂布平板的操作過程中，不可避免的會有少量細菌殘留在涂布棒之上，從而造成平板計數(shù)的誤差；結(jié)合這兩方面原因，檢測結(jié)果會產(chǎn)生一定程度的誤差。同時，相比于10 h增菌的檢測信號值，3 個樣品在增菌10 h之后的信號值均弱于前者，但平板計數(shù)結(jié)果卻遠大于前者，這可能是因為，抗原抗體的結(jié)合力，主要有疏水作用、愛德華力、氫鍵、離子鍵等，過量的抗體或抗原，對于二者最佳的結(jié)合比列，都有消極的影響（即抗原之間相互競爭導致排斥，抗原抗體結(jié)合比率下降），而隨著增菌時間的延長，細菌數(shù)目過多，即抗原的量遠遠大于抗體的量，從而對抗原抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生一定程度的負面影響。最后，從表4可以看出，平板計數(shù)的結(jié)果均在增菌14 h時達到最大值，增菌16 h后細菌數(shù)目反而有所下降，說明在增菌過程中，隨著時間的延長，有限的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗殆盡，大腸菌群生長進入衰亡期，有大量細菌死亡。

圖5 增菌過程中顯色培養(yǎng)基同步涂布平板計數(shù)結(jié)果Fig.5 Spread plate counts from Escherichia coli O157∶H7 chromogenic medium

2.4 抗體宏陣列特異性實驗

如圖6a所示，除去兩株出血性大腸桿菌O157∶H7以外，抗體宏陣列與其他細菌均無交叉反應。

圖6 大腸桿菌O157∶H7抗體陣列特異性實驗Fig.6 Specificity of the antibody macroarray for Escherichia coli O157∶H7

3 討 論

本實驗利用可視化抗體宏陣列技術，探討將高通量的抗體宏陣列，運用于單樣品多指標食源性致病菌快速定量檢測，結(jié)果顯示：抗體宏陣列對出血性大腸桿菌O157∶H7具有很好的特異性，與其他常見食源性致病菌均無交叉反應，模擬增菌實驗結(jié)果良好，其檢出限為3.4×105CFU/mL，靈敏度與酶聯(lián)免疫吸附測定技術（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）相同[15]，但耗時僅為2.5 h，并且節(jié)省抗體，操作簡便快捷，無需特殊設備，對實驗人員要求低，適合基層實驗室進行快速高通量樣品篩查。

在實驗前期，原期望采用3.4×108、3.4×107、3.4×106、3.4×105、3.4×104CFU/mL 5 個菌液濃度作為標準曲線的坐標濃度，但結(jié)果顯示，相比于3.4×107CFU/mL，108菌液的檢測信號值反而弱于前者，這與模擬增菌實驗中出現(xiàn)的10 h之后信號值減弱的現(xiàn)象是相同原因，因此該方法對于目標菌濃度過高的情況下，定量檢測可能與實際細菌數(shù)有較大差異；另外本實驗檢測靈敏度為3.4×105CFU/mL，對104濃度菌液無法檢出，因此不能用于擬合標準曲線。

常見的蛋白質(zhì)芯片技術大都采用熒光標記物釋放檢測信號，需要相應熒光信號檢測系統(tǒng)，成本較高且結(jié)果不穩(wěn)定[16-21]，亦或是對檢測基片進行各種修飾加工，旨在提高檢測靈敏度及特異性[22-23]，雖然有所進步，但無形之中又增加了綜合成本，均不適合基層實驗室進行前期樣品的快速高通量篩查。本實驗研制的可視化抗體宏陣列無需信號采集系統(tǒng)，可直接用肉眼識別檢測結(jié)果，若借助常用計算機軟件，則可實現(xiàn)定量檢測。

食品安全事故的頻繁發(fā)生，推動著檢測技術的不斷進步，簡潔、快速、高通量已成為目前檢測技術的發(fā)展趨勢，基于膠體金免疫層析技術的試紙條近年來在快速檢測領域應用逐漸增多[24-25]，但要實現(xiàn)大量樣品的快速篩查，則其成本較高，并且為定性檢測；抗體宏陣列檢測雖然耗時長于試紙條方法，但仍可在2.5 h之內(nèi)完成檢測，同時更適合高通量檢測。本研究隨后將嘗試在同一芯片陣列之上固定多種捕獲抗體，從而達到同步檢測多種目標細菌的目的，同時為研制蛋白質(zhì)芯片快速檢測試劑盒做前期準備。

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Quantitative Detection of Escherichia coli O157:H7 Based on Visual Antibody Macroarray Technology

LI Hao-lin1,2, LIU Qing2, LIU Fang3, DONG Qing-li2, QIU Shi2, YANG Yu-ping2, GUO Hui-qing4, HAN Shun-yu1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China; 4. Shanghai Prajan Bioiogy Technology Company, Shanghai 200437, China)

Purpose: To establish a new rapid quantitative assay for detecting Escherichia coli O157:H7. Methods: Using nitrocellulose membrane as substrate, an antibody macroarray was fabricated with a biochip spotting robot, and then a double antibody sandwich method was developed for quantitative detection of E. coli O157:H7. Results: The limit of detection (LOD) for E. coli O157:H7 was 3.4 × 105CFU/mL, and a good linear relationship was observed between grey value for the macroarray and bacterial concentration in the range of 105-107CFU/mL. This method could allow simultaneous determination of different concentrations of E. coli O157:H7 in multiple samples. Conclusions: As evaluated by applying it to standard strains and simulated enrichment culture, the antibody macroarray-based method could provide stable and accurate results visible to naked eyes with simple operation and low costs without the use of large equipment. Moreover, the antibody macroarray developed in this study could be used to rapidly assess E. coli O157:H7 pollution in food, especially suitable for rapid screening of samples in grassroots-level laboratories.

Escherichia coli O157:H7; antibody macroarray; visualization; quantitative determination

Q939.91

A

1002-6630（2014）20-0185-07

10.7506/spkx1002-6630-201420037

2013-10-21

國家質(zhì)檢總局科技項目（GSCIQ_2010IK220）；上海市科委重點支撐項目（13430502400）；甘肅省科技支撐計劃項目（1304FKCA056）

李浩林（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：lihaolin36@sina.com

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：lzhansy@126.com