超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮及抑菌性檢測(cè)

劉曉飛，劉 寧，張 娜，荊麗榮，于茲冰，馬永強(qiáng)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮及抑菌性檢測(cè)

劉曉飛，劉 寧，張 娜，荊麗榮，于茲冰，馬永強(qiáng)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

以甜玉米穗軸為原料，利用超聲波輔助纖維素酶法提取其中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，考察纖維素酶作用的酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及酶用量對(duì)甜玉米穗軸中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響。結(jié)果表明：超聲波輔助纖維素酶法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)最佳工藝條件為：超聲處理20 min后，酶解溫度55 ℃、pH 4.8、纖維素酶用量0.008 g/2.0 g甜玉米穗軸、酶解時(shí)間1.5 h，此條件下甜玉米穗軸中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率0.318%。甜玉米穗軸中黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)白葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，最低抑菌質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、2 mg/mL。

甜玉米穗軸；黃酮；超聲波輔助酶法；抑菌活性

甜玉米穗軸俗稱(chēng)玉米芯，是玉米果穗脫去籽粒后的穗軸，占玉米穗20%～30%。我國(guó)玉米年產(chǎn)量位于美國(guó)之后，居世界第二位[1-2]，按3 kg玉米產(chǎn)1 kg玉米芯計(jì)算，僅2013年我國(guó)產(chǎn)生的玉米芯近0.72億 t。目前利用率僅有10%～15%[3]，絕大部分玉米芯作為農(nóng)家燃料被燒掉，造成資源浪費(fèi)。

植物黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，是植物長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物[4]，它具有抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老及降血糖、降血壓、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[5]。黃酮類(lèi)化合物還是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化和清除自由基抗衰老作用，已成為人類(lèi)膳食中的一種不可或缺的抗氧化營(yíng)養(yǎng)因子[6-9]，它在替代人工合成抗氧化劑成為未來(lái)油脂或含油食品添加劑方面擁有巨大潛力[10-12]。甜玉米穗軸中含有黃酮類(lèi)物質(zhì)，最高含量可達(dá)0.05 mg/g[13]。

黃酮的提取方法有水浸提法、索氏提取法、滲透法、水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法、酶法等[14-19]。超聲波能在液體中高頻振動(dòng)并產(chǎn)生“空穴作用”，可以破壞細(xì)胞組織，有助于黃酮類(lèi)化合物的溶出和擴(kuò)散，具有提取時(shí)間短、效率高的優(yōu)點(diǎn)[20-21]。酶法是近年來(lái)運(yùn)用較多的一種技術(shù)，使提取液發(fā)生酶解反應(yīng)，破壞組織細(xì)胞，降低提取條件，從而有利于有效成分的提取，提高提取率[22-23]。為充分利甜玉米穗軸資源，本研究采用超聲波輔助酶法從甜玉米穗軸中提取黃酮類(lèi)化合物，確定最佳提取工藝條件，并測(cè)定其抑菌活性，為今后甜玉米芯的開(kāi)發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)天然抗氧化劑提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜玉米穗軸 哈爾濱市郊區(qū)；纖維素酶（150 000 U/g） 和氏璧生物技術(shù)有限公司；蘆丁中國(guó)食品藥品檢定研究院；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌由哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Y92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新知生物科技股份有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；高速離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；電熱恒溫干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

量取120 ℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用甲醇溶解，定容在100 mL的容量瓶中，制備成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氫氧化鈉溶液10 mL，用蒸餾水定容至25 mL，定容后的溶液放置15 min后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并做空白對(duì)照。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸黃酮單因素試驗(yàn)

選擇新鮮、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變的甜玉米穗軸，粉碎過(guò)80 目篩子，烘干至恒質(zhì)量備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的甜玉米穗軸樣品2.0 g，按料液比1∶20加入蒸餾水后，使用功率520 W的細(xì)胞破碎儀作用20 min，停止超聲，加入纖維素酶。考察酶解時(shí)間、酶用量、酶作用pH值、酶解溫度4 個(gè)單因素對(duì)總黃酮提取率的影響[24]。

黃酮的提取率按照下面公式計(jì)算：

1.3.3 超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸黃酮正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并優(yōu)化黃酮的工藝參數(shù)，如表1所示。將正交試驗(yàn)得出的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 甜玉米穗軸中黃酮的抑菌性測(cè)定

1.3.4.1 紙片法測(cè)定黃酮的抑菌圈[25]

使用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌測(cè)定甜玉米穗軸中黃酮的抑菌性，將菌種接種到液態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，用無(wú)菌水將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫群髠溆?。將黃酮粗提液分別配制成質(zhì)量濃度0.5、1、2 mg/mL的溶液，以不加黃酮為對(duì)照，過(guò)濾除菌，備用。

在超凈工作臺(tái)上，將滅菌的直徑為10 mm圓形濾紙片，浸泡在提取的甜玉米穗軸黃酮液中30 min。分別取約0.4 mL菌懸液，均勻涂布在固體瓊脂平板上，再取浸有黃酮液的濾紙片貼在含菌平板上。每個(gè)平皿貼2個(gè)濾紙片，重復(fù)3 次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察黃酮的抑菌效果，并測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。

1.3.4.2 瓊脂稀釋法測(cè)定黃酮的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[26]

將黃酮粗提液配制成質(zhì)量濃度1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的供試液，過(guò)濾除菌后按瓊脂-黃酮（9∶1，m/m）的比例加入融化的MHA瓊脂（muller hinton agar，MHA），混勻倒板，得到含黃酮分別為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL的瓊脂平板。用移液槍逐一點(diǎn)種供試菌液10 μL，菌液干后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物質(zhì)量濃度為該黃酮液對(duì)檢測(cè)菌的MIC。每個(gè)受試樣平行重復(fù)3 次，以不含黃酮的瓊脂板作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

由不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液得到的線性方程為：y=5.529 8x＋0.002 2，r2=0.999 3。

2.2 超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮工藝的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶用量對(duì)甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖1 不同加酶量對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cellulose dose on the extraction yield of flavonoids

如圖1所示，當(dāng)酶用量為0.008 g時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高，隨著酶添加量的增加，黃酮提取率沒(méi)有明顯提高，說(shuō)明溶液中酶添加量已接近飽和，繼續(xù)提高酶添加量，對(duì)提取率影響不明顯。因此酶添加量選擇0.008 g。

2.2.2 pH值對(duì)甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖2 酶解pH值對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction yield of flavonoids

如圖2所示，在pH值為4.0時(shí)，黃酮提取率最低，隨著pH值的升高而逐漸增加，在pH值為4.8時(shí)，提取率達(dá)到最高，而后隨著pH值的升高，反而提取率下降。因?yàn)槊富盍κ墉h(huán)境的影響，pH值不僅影響酶的構(gòu)象，而且也影響底物的解離狀態(tài)。pH值為4.8時(shí)，纖維素酶處于最佳pH值區(qū)間，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使之最大限度作用于細(xì)胞壁纖維素。因此酶解的最佳pH值選擇為4.8。

2.2.3 酶解溫度對(duì)甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖3 酶解溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of flavonoids

如圖3所示，在40～50 ℃隨著溫度的升高，黃酮提取率不斷增加，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，黃酮提取率最高；在55 ℃時(shí)黃酮提取率減少。因?yàn)楫?dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，酶蛋白受熱變性，從而影響對(duì)細(xì)胞的分解，降低了黃酮提取率。因此酶解最佳溫度選擇為50 ℃。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)甜玉米穗軸黃酮提取率的影響

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of flavonoids

如圖4所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率增加，酶解1.5 h后，提取率增加緩慢，因?yàn)榇藭r(shí)的細(xì)胞壁已基本被破壞，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取率增加的幅度不是很大。本著節(jié)約時(shí)間的原則，選用酶解時(shí)間為1.5 h。

2.2.5 超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮工藝的正交試驗(yàn)及驗(yàn)證結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Scheme and results of orthogonal array design

由表2可以知，最佳提取條件為A2B3C2D2，即酶解時(shí)間為1.5 h、酶解溫度為55 ℃、pH值為4.8、酶用量為0.008 g較為適合；各因素對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率的影響的主次順序依次為pH值＞酶用量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。在此條件下，甜玉米穗軸中黃酮的最佳提取率為0.298%，正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果得到黃酮的提取率為0.318%，比文獻(xiàn)[27]報(bào)道中使用乙醇作為溶劑，振蕩法提取的玉米芯黃酮提取率分別提高11.2%。原因在于超聲波劇烈振蕩產(chǎn)生的空化作用會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的破壞應(yīng)力，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使纖維素酶充分作用在細(xì)胞壁上，能夠使黃酮充分暴露出來(lái)，同時(shí)機(jī)械振動(dòng)作用還能夠加快黃酮在媒介中的傳遞擴(kuò)散。因此，黃酮的提取率有所提高。

2.3 甜玉米穗軸中提取率黃酮的抑菌性結(jié)果

表3 甜玉米穗軸黃酮抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Antibacterial activities of flavonoids from sweet corncobs

如表3所示，甜玉米穗軸黃酮對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC為0.25 mg/mL；其次為大腸桿菌MIC為0.5 mg/mL，白葡萄球菌MIC為2 mg/mL。甜玉米穗軸中黃酮對(duì)大腸桿菌的MIC是文獻(xiàn)[28]報(bào)道的橄欖中黃酮MIC的1 倍，是枯草芽孢桿菌的MIC的0.5 倍。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以來(lái)源豐富的甜玉米穗軸為原料，利用超聲波輔助纖維素酶法提取甜玉米穗軸中的黃酮，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選擇出最佳工藝條件：酶解溫度55 ℃、pH值4.8、纖維素酶用量0.008 g/2 g甜玉米穗軸、酶解時(shí)間1.5 h，此條件下甜玉米穗軸的黃酮提取率為0.318%。甜玉米穗軸中黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)白葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，加之我國(guó)甜玉米產(chǎn)量巨大，甜玉米穗軸黃酮用來(lái)作為天然食品防腐劑前景廣闊。

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Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction and Antimicrobial Activity of Sweet Corncob Flavonoids

LIU Xiao-fei, LIU Ning, ZHANG Na, JING Li-rong, YU Zi-bing, MA Yong-qiang
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Flavonoids were extracted by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of sweet corncobs using cellulase and the optimal extraction conditions were established by orthogonal array design. An ultrasonication time of 20 min followed by enzymatic hydrolysis at 55 ℃ and pH 4.8 for 1.5 h with an enzyme dosage of 0.008 g/2.0 g substrate provided maximum extraction yield of 0.318%. The flavonoids extracted from sweet corncobs had significant antibacterial activity against white Staphylococcus, Escherichia coli and Bacillus subtilis. The minimum inhibitory concentrations were 0.5, 0.25 and 2 mg/mL respectively.

sweet corncob; flavonoids; ultrasonic-assisted enzymatic extraction; antibacterial activity

TS209

A

1002-6630（2014）20-0079-04

10.7506/spkx1002-6630-201420016

2014-02-08

哈爾濱商業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（12DL014）

劉曉飛（1980—），女，講師，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工利用。E-mail：liuxiaofei72@163.com