南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中蛋白水解酶的穩(wěn)定性及自溶特性

丁浩宸，李棟芳，張燕平*，許 剛，徐舒展，黃天翔

（浙江工商大學(xué) 水產(chǎn)品加工研究所，浙江 杭州 310035）

南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中蛋白水解酶的穩(wěn)定性及自溶特性

丁浩宸，李棟芳，張燕平*，許 剛，徐舒展，黃天翔

（浙江工商大學(xué) 水產(chǎn)品加工研究所，浙江 杭州 310035）

以總蛋白酶活力為指標(biāo)，研究3種自制南極磷蝦肉糜（蝦肉糜）5 ℃冷藏過(guò)程中蛋白水解酶的穩(wěn)定性，并以蛋白質(zhì)組分、汁液流失率為指標(biāo)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，研究其自溶特性。結(jié)果表明：在冷藏過(guò)程中，蝦肉糜所含的消化腺蛋白酶穩(wěn)定性較高，未充分漂洗的蝦肉糜受到持續(xù)的水解；蝦肉糜的自溶特性主要表現(xiàn)為鹽溶性蛋白、堿溶性蛋白的降解和水溶性蛋白的增加，且汁液流失率增大和感官品質(zhì)劣化。未漂洗蝦肉糜的自溶現(xiàn)象尤為顯著，不宜冷藏保存，而2次漂洗蝦肉糜在冷藏過(guò)程中自溶特性不顯著，雖然存在一定的蛋白質(zhì)組分變化和汁液流失率增加現(xiàn)象，但感官品質(zhì)未大幅下降，因而適宜于短時(shí)間內(nèi)在5 ℃進(jìn)行冷藏保存。

南極磷蝦肉糜；冷藏；蛋白水解酶；自溶特性

南極磷蝦（Euphausia superba）是一類(lèi)生物量巨大的海洋甲殼類(lèi)動(dòng)物，預(yù)估其生物量在4～15億t，被認(rèn)為是地球上最大的動(dòng)物蛋白庫(kù)[1-2]。作為一種具有獨(dú)特蛋白酶系統(tǒng)和自溶特性的水產(chǎn)食品資源，南極磷蝦的生化特性已受到了多方關(guān)注和研究[3-7]。南極磷蝦死亡后，蝦體中的蛋白水解酶立即被激活并引發(fā)蝦體的快速自溶，自溶作用則促進(jìn)蝦體品質(zhì)劣化，這被認(rèn)為是南極磷蝦完全商業(yè)化加工和新型磷蝦食品開(kāi)發(fā)的主要障礙[8-10]。

2010年以來(lái)，中國(guó)成功進(jìn)行了數(shù)次南極磷蝦探捕并開(kāi)始統(tǒng)籌發(fā)展磷蝦產(chǎn)業(yè)，對(duì)于磷蝦肌肉蛋白質(zhì)的利用是目前基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品研發(fā)的重要方向之一[11]。經(jīng)采肉、漂洗、脫水和速凍獲得的南極磷蝦肉糜是南極磷蝦初級(jí)加工的重要分支產(chǎn)品[11]，以其為中間原料可以用于制備、生產(chǎn)南極磷蝦風(fēng)味的水產(chǎn)食品和營(yíng)養(yǎng)基料。

李學(xué)英等[12]以pH值、出肉率和可溶蛋白含量為指標(biāo)對(duì)南極磷蝦0～3 ℃冷藏過(guò)程中的品質(zhì)變化進(jìn)行了研究；遲海等[13]對(duì)南極磷蝦0、5 ℃條件下微生物、揮發(fā)性鹽基氮和三甲胺氮指標(biāo)的變化趨勢(shì)進(jìn)行了研究。但國(guó)內(nèi)外針對(duì)南極磷蝦肉糜的研究報(bào)道較少。而南極磷蝦肉糜的部分加工利用環(huán)節(jié)和流通零售渠道都處于冷藏溫度環(huán)境。因此，探討冷藏條件下南極磷蝦肉糜酶學(xué)特性和自溶特性的變化對(duì)其實(shí)際加工利用有一定的理論指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)自制3種不同的南極磷蝦肉糜，研究其在5 ℃冷藏過(guò)程中總蛋白酶活力的變化，并以蛋白質(zhì)組分、汁液流失率和感官品質(zhì)為指標(biāo)研究其自溶特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦整蝦凍塊 遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，南極磷蝦為2012年2月從南極海域捕獲并低溫凍藏，當(dāng)年10月運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

滾筒采肉機(jī) 廣東鼎成機(jī)械有限公司；液媒速凍機(jī)大連比澤安航制冷設(shè)備有限公司；DW-40L92醫(yī)用低溫保存箱、BCD-251WBSV冰箱 海爾集團(tuán)；T18 basic均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；RC 6 PLUS冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；K-435消化爐、B-324凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；Free Zone 2.5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦肉糜的制備

南極磷蝦整蝦凍塊切割成小塊（5 cm×5 cm×5 cm），于10 ℃環(huán)境下半解凍至磷蝦個(gè)體易于分離。采用滾筒采肉機(jī)進(jìn)行脫殼采肉，選取3 mm孔徑網(wǎng)狀滾筒。將采肉獲得的南極磷蝦肉糜在漂洗槽中以10倍水量的0 ℃冰水進(jìn)行1～2次漂洗，每次漂洗10 min，漂洗后的南極磷蝦肉糜進(jìn)行擠壓脫水。通過(guò)上述工藝分別獲得未漂洗南極磷蝦肉糜、1次漂洗南極磷蝦肉糜和2次漂洗南極磷蝦肉糜。將3種南極磷蝦肉糜（蝦肉糜）真空袋裝后液媒速凍至－30 ℃，貯藏于－30 ℃低溫冰箱備用。

1.3.2 總蛋白酶活力測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品，按1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）提取粗酶液。Folin酚法測(cè)定粗酶液總蛋白酶活力；以1%酪蛋白為底物，37 ℃水浴反應(yīng)，每分鐘水解生成1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[9]。105 ℃烘干恒質(zhì)量法測(cè)定待測(cè)樣品中干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計(jì)算待測(cè)樣品總蛋白酶活力，以U/g干質(zhì)量表示。

1.3.3 蛋白質(zhì)組分分析

參照Hashimoto等[14]方法分離待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)組分，分離獲得非蛋白氮（non-protein nitrogen compound，NPN）、水溶性蛋白質(zhì)（water-soluble protein，WSP）、鹽溶性蛋白質(zhì)（salt-soluble protein，SSP）、堿溶性蛋白質(zhì)（alkali-soluble protein，ASP）。凱氏定氮儀測(cè)定各蛋白質(zhì)組分的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)=總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)×6.25

1.3.4 汁液流失率測(cè)定

采用離心法測(cè)定汁液流失率，取10 g待測(cè)樣品于離心管，4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，倒去上層汁液，稱(chēng)量殘余蝦肉質(zhì)量，以損失汁液占待測(cè)樣品鮮質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算為汁液流失率。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

由10名評(píng)價(jià)員組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)蝦肉糜樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)以蝦肉糜的肉糜色澤、組織質(zhì)感、水煮氣味為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各項(xiàng)指標(biāo)為1～10分，根據(jù)表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。取3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)得分的平均值為樣品的綜合感官評(píng)分。

表1 南極磷蝦肉糜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Antarctic krill paste

1.3.6 冷藏實(shí)驗(yàn)

將3種蝦肉糜切割成片狀（厚度1 cm），在5 ℃條件下進(jìn)行24 h冷藏實(shí)驗(yàn)。于冷藏過(guò)程中，間隔一定時(shí)間取樣進(jìn)行總蛋白酶活力測(cè)定、蛋白質(zhì)組分分析、汁液流失率測(cè)定和感官評(píng)定。

1.3.7 南極磷蝦肉糜蛋白水解酶來(lái)源分析

南極磷蝦整蝦解凍至個(gè)體分開(kāi)。隨機(jī)選取20尾蝦體完整飽滿(mǎn)的南極磷蝦（不區(qū)分雌雄和體長(zhǎng)），沿頭胸甲后緣切開(kāi)，將蝦體分為頭胸部和腹部[15]。真空冷凍干燥24 h后稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算南極磷蝦頭胸部、腹部干質(zhì)占整蝦干質(zhì)的比例，重復(fù)測(cè)定10次。以上述方法分離蝦體，分別測(cè)定南極磷蝦頭胸部和腹部的總蛋白酶活力，重復(fù)測(cè)定5次，并計(jì)算南極磷蝦頭胸部、腹部蛋白酶活力分別占整蝦總蛋白酶活力的比例。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以one-way ANOVA分析數(shù)據(jù)，Duncan新復(fù)極差法分析平均值之間的差異。采用OriginPro 7.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中蛋白水解酶穩(wěn)定性

表2 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中總蛋白酶活力的變化（x±s=5）Table 2 Changes in total proteolytic activity of Antarctic krill pastes during chilling storage (x±s , = 5)

表2所示為3種蝦肉糜在5 ℃冷藏過(guò)程中總蛋白酶活力的變化。未漂洗蝦肉糜的初始總蛋白酶活力最高，經(jīng)過(guò)1～2次漂洗，蝦肉糜的初始總蛋白酶活力分別下降49.2%、74.3%。未漂洗蝦肉糜的總蛋白酶活力在5 ℃冷藏的前6 h內(nèi)下降不顯著，1次、2次漂洗蝦肉糜則呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。冷藏24 h后，未漂洗、1次漂洗蝦肉糜的總蛋白酶活力分別下降為初始值的68.2%、41.6%，但蛋白酶活力數(shù)值仍較大；由此可見(jiàn)，磷蝦肉糜中的蛋白酶在5 ℃冷藏溫度條件下穩(wěn)定性較高。2次漂洗蝦肉糜冷藏24 h后未檢出總蛋白酶活力，可能是由于其初始值較低所致。杭虞杰等[16]對(duì)南極磷蝦蛋白酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，蛋白酶液4 ℃條件下保存60 min，殘留酶活力在90%以上，同樣證明了南極磷蝦蛋白酶在冷藏溫度條件下的穩(wěn)定性。蛋白水解酶的穩(wěn)定性使得漂洗不徹底的蝦肉糜在冷藏過(guò)程中持續(xù)處于蛋白酶的酶解作用之下，進(jìn)而表現(xiàn)出自溶特性。

2.2 南極磷蝦肉糜蛋白水解酶來(lái)源分析

表3 南極磷蝦頭胸部、腹部的干質(zhì)量比例和總蛋白酶活力分布比例（以干質(zhì)量計(jì)）Table 3 Weight ratio (dry basis) and proteolytic activity ratio of cephalothorax and tail in whole Antarctic krill (dry basis)

由表3可知，南極磷蝦頭胸部干質(zhì)量?jī)H占整蝦的42.82%，但其總蛋白酶活力高達(dá)857.83 U/g干質(zhì)量；而腹部的肌肉組織中所含的總蛋白酶活力僅占整蝦總蛋白酶活力的4.49%。3種自制蝦肉糜中的總蛋白酶活力均高于南極磷蝦腹部的總蛋白酶活力，可見(jiàn)蝦肉糜中的蛋白水解酶活力主要來(lái)源于南極磷蝦頭胸部。Kawamura等[17]將南極磷蝦頭胸部和腹部分離，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)存放的腹部組織自溶緩慢，磷蝦整蝦的自溶速度近似于頭胸部，并認(rèn)為這是頭胸部消化腺蛋白酶向腹部肌肉滲透所致。而南極磷蝦采肉工藝更使得磷蝦消化腺蛋白酶大量分布于蝦肉糜產(chǎn)品中，因此，需要對(duì)蝦肉糜中因蛋白酶引起的自溶特性高度重視。

2.3 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組分變化

表4 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化（x±s=5）Table 4 Changes in protein components of Antarctic krill pastes during chilling storage x±s , = 5)

表4所示為3種蝦肉糜在冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化。未漂洗蝦肉糜的初始蛋白質(zhì)組分主要為NPN和WSP，且在冷藏中呈顯著增加（P＜0.05），而SSP和ASP則呈顯著減少（P＜0.05），表現(xiàn)為強(qiáng)烈的自溶特性。1次漂洗蝦肉糜的初始蛋白質(zhì)組分主要為ASP，這是由于漂洗降低了NPN和WSP所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。但冷藏中，NPN、WSP同樣呈顯著增加（P＜0.05），SSP顯著減少（P＜0.05），表現(xiàn)為明顯的自溶特性。2次漂洗蝦肉糜中NPN和WSP所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小，且24 h冷藏中的增量較??；SSP在冷藏中僅減少了39.2%，ASP無(wú)顯著變化（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，2次漂洗蝦肉糜的自溶特性顯著弱于未充分漂洗的蝦肉糜。NPN主要包括游離氨基酸、寡肽及核苷酸等物質(zhì)，屬于滋味物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)前體；其協(xié)同作用有助于形成復(fù)雜的風(fēng)味[18]。WSP主要為肌漿蛋白和多肽，含有大量的蛋白水解酶。鹽溶性的肌原纖維蛋白對(duì)組織形態(tài)和持水力的維持起重要作用。蛋白質(zhì)組分的變化從蛋白質(zhì)分子的層面解釋了蝦肉糜冷藏中自溶特性的作用機(jī)理。蝦肉糜中的SSP和ASP受自溶特性影響，其降解減少會(huì)導(dǎo)致蝦肉糜肌肉組織狀態(tài)的劣化。Ellingsen等[7]研究同樣指出磷蝦蛋白酶會(huì)首先作用于肌肉中的SSP，將其大量水解成多肽和游離氨基酸。Kolakowski[19]研究認(rèn)為南極磷蝦在自溶階段后，會(huì)進(jìn)入微生物腐敗階段，進(jìn)而導(dǎo)致氣味和風(fēng)味的劣化，而蝦肉糜冷藏過(guò)程中大量增多的NPN和WSP則是有利于微生物繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[20]。

2.4 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中汁液流失率變化

圖1 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中汁液損失率的變化Fig.1 Changes in drip loss of Antarctic krill pastes during chilling storage

汁液流失率是衡量肉類(lèi)蛋白質(zhì)持水性的指標(biāo)，能反映水產(chǎn)品肌肉在貯藏過(guò)程中的汁液流失程度，滲出的汁液會(huì)降低商品價(jià)值[21-22]。圖1為3種蝦肉糜5 ℃冷藏中汁液流失率的變化。漂洗蝦肉糜初始汁液流失率大于未漂洗蝦肉糜，主要是由于蝦肉在漂洗中吸水所致。未漂洗蝦肉糜在冷藏中汁液流失率持續(xù)增大（P＜0.05），且冷藏24 h后汁液流失率達(dá)到53.0%。1次漂洗蝦肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h同樣呈顯著增大（P＜0.05），而后增速減緩。2次漂洗蝦肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h內(nèi)也有所上升，之后則無(wú)顯著變化（P＞0.05）。肉類(lèi)組織中肌球蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和存在狀態(tài)是決定肌肉持水性的關(guān)鍵因素[23]。蛋白質(zhì)結(jié)合水脫離和自由水反復(fù)凍融是水產(chǎn)品肌肉在冷藏、凍藏過(guò)程中出現(xiàn)汁液流失現(xiàn)象的2個(gè)主要誘因[24]。蝦肉糜中SSP所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小是其汁液流失率初始值均較高的主要原因，而自溶特性引起的蛋白質(zhì)降解則導(dǎo)致汁液流失率不斷增大。結(jié)合2.3節(jié)中蛋白質(zhì)組分的變化，分析認(rèn)為未漂洗蝦肉糜中的非NPN和WSP隨水分大量流失是其汁液流失率激增的主要原因之一。

2.5 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中感官變化

圖2 南極磷蝦肉糜冷藏過(guò)程中的感官評(píng)分變化Fig.2 Changes in sensory evaluation score of Antarctic krill pastes during chilling storage

感官評(píng)價(jià)是通過(guò)視覺(jué)、觸覺(jué)、嗅覺(jué)和味覺(jué)綜合感知食品、原料的特征和性質(zhì)的科學(xué)方法，其結(jié)果具有一定主觀(guān)性，但通常接近消費(fèi)者和下游加工企業(yè)的判定標(biāo)準(zhǔn)[25]。3種蝦肉糜5 ℃冷藏中感官評(píng)分的變化如圖2所示。經(jīng)過(guò)漂洗的2種蝦肉糜，其初始感官評(píng)分高于未漂洗蝦肉糜，處于優(yōu)級(jí)。未漂洗蝦肉糜的感官評(píng)分在冷藏的前9 h下降顯著（P＜0.05），且冷藏3 h后感官評(píng)分即低于4分，達(dá)到差級(jí)。而1次漂洗蝦肉糜的感官評(píng)分在冷藏的前6 h同樣下降顯著（P＜0.05），但冷藏24 h后感官評(píng)分仍處于良級(jí)。2次漂洗蝦肉糜感官評(píng)分在24 h冷藏中變化趨勢(shì)平緩，在12～24 h中變化不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，3種蝦肉糜冷藏中的感官變化趨勢(shì)存在較大區(qū)別，直觀(guān)反應(yīng)出不同蝦肉糜自溶特性的差異化。未漂洗蝦肉糜自溶特性顯著，冷藏保存會(huì)使其感官品質(zhì)快速劣化，而漂洗蝦肉糜的自溶特性較弱，在短時(shí)間內(nèi)適于冷藏保存，但其感官品質(zhì)仍會(huì)受到不同程度的影響。

3 結(jié) 論

南極磷蝦肉糜中的蛋白水解酶主要為南極磷蝦頭胸部的消化腺蛋白酶，在5 ℃冷藏條件下具有較高的穩(wěn)定性，能持續(xù)作用于磷蝦肌肉蛋白質(zhì)。南極磷蝦肉糜的自溶特性具體表現(xiàn)為鹽溶性、堿溶性蛋白質(zhì)的降解，水溶性組分增加，直觀(guān)的體現(xiàn)為汁液流失率增大和感官品質(zhì)劣化。不同加工方式獲得的南極磷蝦肉糜因其蛋白水解酶活力的差別而呈現(xiàn)出差異化的自溶特性強(qiáng)度。在3種自制磷蝦肉糜中，2次漂洗蝦肉糜感官評(píng)分最高且在5 ℃冷藏中自溶特性較弱，但要工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)的南極磷蝦肉糜，仍需要深入研究漂洗工藝的優(yōu)化及酶抑制劑的使用。

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Stability of Proteolytic Enzymes and Autolysis Characteristics of Antarctic Krill Paste during Chilling Storage

DING Hao-chen, LI Dong-fang, ZHANG Yan-ping*, XU Gang, XU Shu-zhan, HUANG Tian-xiang
(Institute of Aquatic Products Processing, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Three different kinds of Antarctic krill pastes were prepared. The total proteolytic activity was adopted as an index to study the stability of proteolytic enzymes in Antarctic krill pastes during chilling storage at 5 ℃. Furthermore, the autolysis characteristics of Antarctic krill pastes were also investigated via analysis of protein components, drip loss and sensory quality. The results indicated that the proteolytic enzymes of Antarctic krill pastes which originated from its digestive organs were stable during chilling storage. The Antarctic krill paste prepared without sufficient rinsing was under durative state of autolysis during storage. The autolysis characteristics of Antarctic krill pastes mainly embodied in protein degradation, rise of drip loss and deterioration of the sensory quality. The Antarctic krill paste prepared without rinsing was not suitable for storage at refrigerated temperature, since its autolysis phenomena were particularly remarkable. However, the autolysis characteristics of Antarctic krill paste prepared by rinsing twice were not significant. The sensory quality was not seriously deteriorated though protein degradation and rise of drop loss still existed. Therefore, the Antarctic krill paste being rinsed twice was suitable for storage at refrigerated temperature within a short period of time.

Antarctic krill paste; chilling storage; proteolytic enzyme; autolysis characteristics

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201404041

2013-05-23

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目；浙江工商大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（1110XJ1512119）

丁浩宸（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：dinghaochen1988@126.com

*通信作者：張燕平（1962—），女，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)生物化學(xué)。E-mail：zhangyanping@zjgsu.edu.cn