嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌解旋酶恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立

周 巍，張 薇，劉 亮，劉 東，李永波，田 浩，張 巖,*，張志勝*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091）

嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌解旋酶恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立

周 巍1,2，張 薇2，劉 亮2，劉 東2，李永波2，田 浩2，張 巖2,*，張志勝1,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091）

目的：建立一種檢測(cè)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的解旋酶恒溫基因擴(kuò)增方法。方法：根據(jù)阪崎克羅諾桿菌ITS基因設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化解旋酶恒溫基因擴(kuò)增法反應(yīng)條件UvrD helicase、T4 gp32的濃度，人工添加阪崎克羅諾桿菌確定檢出限，多種致病菌在建立的解旋酶恒溫基因擴(kuò)增體系中擴(kuò)增驗(yàn)證特異性，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果：解旋酶恒溫基因擴(kuò)增法檢測(cè)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌得到與設(shè)計(jì)序列長(zhǎng)度一致的100 bp基因片段，檢出限為10 CFU/g，優(yōu)化反應(yīng)條件UvrD helicase、T4 gp32的終濃度分別為0.1、5.0 μg。結(jié)論：解旋酶恒溫基因擴(kuò)增法用于檢測(cè)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，為嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的快速檢測(cè)提供了新的方法。

解旋酶恒溫基因擴(kuò)增法；嬰兒配方乳粉；阪崎克羅諾桿菌；檢測(cè)

食品安全問(wèn)題是關(guān)系到人民大眾切身利益的敏感話題。嬰兒配方乳粉是針對(duì)于新生兒的特定食品，營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠滿足嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的日常需要，其安全性尤為重要。阪崎克羅諾桿菌是嬰兒配方乳粉主要的微生物安全指標(biāo)，其條件致病性和嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的不完全性易對(duì)嬰兒身體健康造成傷害，因此阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)與控制已經(jīng)成為影響嬰兒食品安全的重要因素。

分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于致病菌檢測(cè)領(lǐng)域[1-10]，主要有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、熒光探針檢測(cè)技術(shù)、基因芯片技術(shù)。依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增（helicase-dependent isothermal DNAamplification，HDA）方法是近年來(lái)以PCR法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的體外恒溫基因擴(kuò)增方法，具有所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、假陽(yáng)性低等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足食品中致病菌快速檢測(cè)的需求。

本研究擬將HDA方法應(yīng)用于嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)中，利用HDA法自身的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的HDA快速檢測(cè)方法，以期為檢驗(yàn)檢疫部門(mén)提供更多的方法，為HDA法在其他致病菌檢測(cè)上的推廣提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)中所采用的菌株詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 The strains tested in this study

1.1.2 樣品

市購(gòu)嬰兒配方乳粉，經(jīng)GB 4789.40—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》檢驗(yàn)證實(shí)不含有阪崎克羅諾桿菌。

1.1.3 試劑

DNA Marker、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、dNTPs、引物（正向引物、反向引物） 大連寶生物工程公司；海藻糖 美國(guó)Sigma公司；大腸桿菌UvrD解旋酶 上海富眾生物科學(xué)有限公司；Bst polymerase、MutL protein、T4 gp32 New England公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒生物工程（上海）有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

DXY-33A型電泳儀 北京市六一廠；UVIpro凝膠成像系統(tǒng) 華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司；6400型恒溫金屬浴上海東升儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌基因組DNA的提取[11-12]

取已經(jīng)預(yù)熱至44 ℃、滅菌的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基100 mL接種阪崎克羅諾桿菌（CICC21560），（36±1） ℃培養(yǎng)（18±2）h。取1 mL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液與10 mL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素混合，于（44±0.5） ℃培養(yǎng)（24±2）h，然后取1 mL增菌液用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取阪崎克羅諾桿菌基因組DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)分析阪崎克羅諾桿菌基因序列，確定以16S rDNA和23S rDNA之間的ITS基因序列為靶標(biāo)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)Oligo 6.0進(jìn)行驗(yàn)證，再進(jìn)行BLAST在線比對(duì)后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定引物。

表2 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 2 The primer sequences and the size of the PCR products

1.2.3 HDA反應(yīng)體系的優(yōu)化及建立

采用一步法HDA反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為：5 μL 10×buffer（100 mmol/L二硫蘇糖醇、350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L MgSO4、1 mg/mL BSA），0.04 μmol dNTPs，0.16 μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.1 μg UvrD helicase，5.0 μg T4 gp32，25 μmol/L海藻糖，2 μL模板DNA，20 pmol引物，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。其中對(duì)反應(yīng)體系中UvrD helicase（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg）、T4 gp32（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg）的終濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終建立HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的反應(yīng)體系。

將反應(yīng)體系放入金屬浴中65 ℃恒溫2 h。2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V）45 min檢測(cè)產(chǎn)物。

1.2.4 HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的檢出限

嬰兒配方乳粉購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?，在人工添加阪崎克羅諾桿菌前，該乳粉按標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)證實(shí)不含有阪崎克羅諾桿菌。將阪崎克羅諾桿菌人工添加到乳粉中，使樣品中阪崎克羅諾桿菌濃度依次為100～108CFU/g，直接提取人工添加的乳粉中阪崎克羅諾桿菌的基因組DNA進(jìn)行HDA法檢測(cè)。

1.2.5 HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的特異性

將表1中所涉及的菌種按照試劑盒法進(jìn)行提取基因組DNA，按照1.2.3節(jié)建立的方法同時(shí)進(jìn)行HDA檢測(cè)，2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V、45 min）檢測(cè)產(chǎn)物。

2 2 結(jié)果與分析

2.1 HDA反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

圖1 阪崎克羅諾桿菌HDA法UvrD helicase優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of final UvrD helicase concentration by Cronobacter sakazakii by HDA

圖2 阪崎克羅諾桿菌HDA法T4 gp32優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of final T4 gp32 concentration by Cronobacter sakazakii by HDA

由圖1、2可見(jiàn)，針對(duì)建立的阪崎克羅諾桿菌HDA檢測(cè)體系，對(duì)反應(yīng)體系中UvrD helicase（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg）、T4 gp32（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg）的終濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定UvrD helicase、T4 gp32的終濃度分別為0.1、5.0 μg。

2.2 HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的檢出限

通過(guò)對(duì)嬰兒配方乳粉人工添加阪崎克羅諾桿菌，濃度梯度為100～106CFU/g，進(jìn)行HDA法檢測(cè)。由圖3可以看出，101～106CFU/g均能夠獲得100 bp的電泳條帶，且清晰無(wú)非特異性條帶，100CFU/g則沒(méi)有電泳條帶，可以得出，HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的檢出限為101CFU/g。

圖3 阪崎克羅諾桿菌HDA法檢出限Fig.3 Sensitivity of detection of Cronobacter sakazakii by HDA

2.3 HDA法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的特異性結(jié)果

對(duì)表1中所有菌種按照HDA法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性，通過(guò)圖4可以看出，表1中4種阪崎克羅諾桿菌均能被有效地?cái)U(kuò)增出100 bp長(zhǎng)度的目的片段，而且電泳條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增；表1中其他11種菌種均未產(chǎn)生電泳條帶，說(shuō)明沒(méi)有基因擴(kuò)增。因此，可以證明該方法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的特異性較好。

圖4 阪崎腸桿菌HDA法特異性Fig.4 Specificity of HDA system in detection of Cronobacter sakazakii

3 討 論

阪崎克羅諾桿菌作為嬰兒配方乳粉中主要的致病菌已經(jīng)引起了高度的重視，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)成為制約其檢測(cè)效率的重要因素，目前，基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法被廣泛的開(kāi)發(fā)出來(lái)，范宏英等[1]建立阪崎克羅諾桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，并與PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，最終確定LAMP檢測(cè)限為10 CFU/mL，PCR檢測(cè)限為102CFU/mL，同時(shí)對(duì)36株近源菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，LAMP和PCR兩種方法均有很好的特異性。

阪崎克羅諾桿菌的ITS序列是其基因檢測(cè)技術(shù)的主要目的序列[13-14]，Baron等[15]通過(guò)分析阪崎克羅諾桿菌的基因序列，采用了ITS序列和其他的表征序列完成的阪崎克羅諾桿菌的篩選和分型工作。Roy等[16]利用ITS間區(qū)序列完成了病毒和致病菌的同體系檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了阪崎克羅諾桿菌和侵染病毒的快速檢測(cè)工作。

HDA方法即賴HDA方法在致病菌檢測(cè)的應(yīng)用已有相關(guān)報(bào)道，王建廣等[17]利用HDA法對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行了檢測(cè)，最低檢測(cè)限為460 pg/tube，與普通PCR相當(dāng)；石琰璟等[18]通過(guò)HDA法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行了檢測(cè)，最低檢測(cè)限為19.9 ng/mL，與普通PCR相當(dāng)。因此，HDA法對(duì)于致病菌檢測(cè)是有一定的應(yīng)用前景的。同時(shí)，HDA法有其自身的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，首先，相比較普通PCR和熒光PCR，該方法不需要昂貴的設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室就能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求，但是HDA法不具備定量檢測(cè)的能力；其次，相比環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，雖然兩者均不需要昂貴的儀器設(shè)備，在等溫的條件下就能夠完成實(shí)驗(yàn)，但是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求較高，引物的靈敏度較高，這就很容易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，而HDA法不存在這一現(xiàn)象，但是昂貴的UvrD helicase、T4 gp32確實(shí)是制約該方法推廣的主要因素，但隨著現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)的推進(jìn)，HDA法的應(yīng)用前景還是非常廣泛的，可成為現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)中的重要組成部分。

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Detection of Cronobacter sakazakii in Infant Formula Powder by Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification Assay

ZHOU Wei1,2, ZHANG Wei2, LIU Liang2, LIU Dong2, LI Yong-bo2, TIAN Hao2, ZHANG Yan2,*, ZHANG Zhi-sheng1,*
(1. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China; 2. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050091, China)

Objective: The aim of this study was to establish a helicase-dependent isothermal DNA amplification (HAD) method for rapid and accurate detection of Cronobacter sakazakii in infant formula powder. Methods: A pair of oligonucleotide primers exclusively targeting the internal transcribed spacer (ITS) gene of Cronobacter sakazakii was designed, and the final concentration of UvrD helicase and T4 gp32 were optimized. Cronobacter sakazakii in infant formula powder was then directly detected by this method and amplification products were separated and detected by agarose gel electrophoresis. Results: An amplicon of 100 bp in length was obtained, which was the same as the designed gene fragment by HDA. The sensitivity of HDA was 101CFU/g, the optimized concentration of UvrD helicase was 0.1 μg, and T4 gp32 was 5.0 μg. Conclusion: The helicase-dependent isothermal DNA amplification assay provides a new, specific, sensitive and fast for the detection of Cronobacter sakazakii in infant formula powder.

helicase-dependent isothermal DNA amplification (HDA); infant formula powder; Cronobacter sakazakii; detection

TS201.3

A

1002-6630（2014）04-0155-04

10.7506/spkx1002-6630-201404032

2013-08-01

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目（100108）

周?。?983—），男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zhouwei0311@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：snowwinglv@126.com

張志勝（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工原理及技術(shù)。E-mail：13833035679@139.com