高壓結(jié)合酶法消減南美白對蝦蝦仁致敏性

張 悅，胡志和*，謝丹丹，吳子健，薛 璐，李 洋

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，天津 300134）

高壓結(jié)合酶法消減南美白對蝦蝦仁致敏性

張 悅，胡志和*，謝丹丹，吳子健，薛 璐，李 洋

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，天津 300134）

以南美白對蝦蝦仁為原料，研究高壓結(jié)合酶法對蝦仁過敏原致敏性的消減作用。將南美白對蝦去頭去尾去殼去腸線后，采用超高壓法和高壓結(jié)合酶法消減其致敏性，用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測致敏性消減效果，確定消減條件。結(jié)果表明：采用超高壓法處理，在壓力100 MPa、溫度25 ℃、保壓時間15 min的條件下，蝦仁過敏原的致敏性降低了67.09%，且與處理過程中蛋白溶出量有關(guān)；采用高壓結(jié)合酶法處理，在鹽水質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶與蝦仁質(zhì)量比1∶130、壓力450 MPa、溫度40 ℃、保壓時間55 min的條件下，蝦仁過敏原的致敏性降低了86.58%。由此可見，高壓處理對蝦仁過敏原的致敏性有消減作用，高壓結(jié)合酶法的消減效果更好。

南美白對蝦；高壓法結(jié)合酶法；木瓜蛋白酶；過敏原消減

食品安全問題受到越來越多人的重視，全球有30%～40%的人患有各種過敏性疾病，并且每年的發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，美國大約有6%的幼兒和3.7%的成年人對某些食品過敏[2-3]，其中海產(chǎn)品就是引起過敏的食品中的一種[4-5]。有報道指出，學(xué)齡兒童的食物過敏現(xiàn)象呈上升趨勢，與1997年相比，2007年美國學(xué)齡兒童食物過敏人數(shù)增加了18%[6-7]。近年來也出現(xiàn)了許多關(guān)于食用海產(chǎn)品致敏的報道[8-12]。在海產(chǎn)品過敏原消減研究方面，國內(nèi)外采用的研究方法包括物理法（加熱[13]、輻照[14]、微波[15]、超高壓[16-17]）、化學(xué)法[18]和生物法[19-22]等。在上述研究中，所采用原料主要針對分離純化后過敏原蛋白進(jìn)行消減，其研究過程排除了原料中其他成分對過敏原消減效果的影響。對采用整體原料，在不破壞原有形狀或組織狀態(tài)下消減其致敏性的研究鮮有報道。

本研究以南美白對蝦蝦仁為研究對象，采用超高壓法和高壓結(jié)合酶法對整體蝦仁進(jìn)行處理，消減過敏原蛋白的致敏性。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）對處理后蝦仁致敏性的消減程度進(jìn)行評價，比較其消減效果，為生產(chǎn)低致敏性蝦仁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮活的南美白對蝦 市售；海蝦過敏人血清天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，過敏血清池由12人血清（7男，5女；年齡分布：20～23歲7人，52歲1人，35～40歲4人），血清置于－80 ℃冰箱凍存。

木瓜蛋白酶（0.5～2 U/mg）、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗人血清免疫球蛋白E（IgE）抗體A9667 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L3型超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DK-42型電熱恒溫水浴槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；3-18K型離心機(jī) 美國Sigma公司；Scientz-50N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1104N型電子天平 上海精密科技儀器有限公司；RT-6000型酶標(biāo)分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 過敏原蛋白的提取

將處理過的南美白對蝦蝦仁放在勻漿機(jī)中勻漿，每克組織用1 mL的生理鹽水懸浮，懸浮液置于冰上5 min后加入4倍體積冷丙酮（－20 ℃預(yù)冷過夜），混勻。4 ℃、10 000 r/min離心15 min，將沉淀物移至干凈濾紙上，分散并自然風(fēng)干，即為丙酮粉。丙酮粉與1 mol/L KCl抽提液（含0.5 mmol/L二硫蘇糖醇）按料液比1∶10（g/mL）抽提過夜，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀物與抽提液按1∶10抽提4 h，離心取上清液，將兩次的上清液合并后透析過夜，再冷凍干燥[23-24]。

1.3.2 超高壓處理對蝦仁過敏原消減效果

將南美白對蝦去頭去尾去殼去腸線后，再將蝦仁表面的薄膜去掉，每10 g蝦加0.85 g/100 mL的鹽水（pH 6.5）40 mL，裝袋后真空密封，然后進(jìn)行高壓處理。

1.3.2.1 單因素試驗

按照方法1.3.1節(jié)提取處理后的蝦仁中的蛋白，設(shè)定保壓時間30 min、壓力300 MPa、溫度30 ℃，通過ELISA檢測致敏性，固定其他條件，分別探討壓力（100、200、300、500 MPa）、溫度（20、30、40、50 ℃）以及保壓時間（10、20、30、50 min）對過敏原的消減效果的影響。

將處理后的鹽溶液取出，透析，冷凍干燥，將干燥后的物質(zhì)（即蝦仁中溶出的蛋白）分成兩部分，一部分直接進(jìn)行ELISA檢測，確定高壓法對溶出的過敏蛋白的消減效果；另一部分檢測蛋白含量（凱氏定氮法），確定蛋白溶出的量。

1.3.2.2 條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以壓力大小、溫度以及保壓時間為影響因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗。處理后的蝦仁提取蛋白，檢測過敏原消減效果。

1.3.3 高壓結(jié)合酶法對蝦仁中過敏原消減效果

1.3.3.1 單因素試驗

將南美白對蝦去頭去尾去殼去腸線后，再將蝦仁表面的薄膜去掉，按每10 g蝦加0.85 g/100 mL的鹽水（pH6.5）40 mL，按照酶與蝦仁質(zhì)量比為1∶200加入木瓜蛋白酶[17]，裝袋、真空密封后進(jìn)行高壓處理。

單因素試驗操作同1.3.2.1節(jié)。

1.3.3.2 條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以壓力大小、溫度以及保壓時間為影響因素，以492 nm波長處的光密度（optical density，OD）值為考察目標(biāo)（每組做6個平行，取均值），按照L9（34）設(shè)計正交試驗。處理后的蝦仁提取蛋白，檢測過敏原消減效果。

1.3.4 鹽水質(zhì)量濃度對蝦仁過敏原致敏性消減效果影響

改變處理蝦仁的鹽水的質(zhì)量濃度（0.85、1.0、1.25、1.5 g/100 mL），利用高壓結(jié)合酶法的優(yōu)化的條件對蝦仁進(jìn)行處理。處理后的蝦仁，檢測致敏性消減效果。

1.3.5 間接酶聯(lián)免疫檢測方法[25]

包被抗原時每個樣品做6個平行孔，在酶標(biāo)板上每孔加100 μL（10 mg/mL）待測物，置于4 ℃包被過夜。用洗液洗5次，每次3 min，拍干。每孔加封閉液200 μL磷酸鹽吐溫緩沖液含1 g牛血清白蛋白，37 ℃水浴3 h，洗滌后拍干，每孔加入100 μL一抗（用封閉液稀釋20倍的過敏人血清），37 ℃水浴2 h，洗滌后拍干，加入用HRP標(biāo)記的羊抗人IgE，37 ℃水浴2 h。洗滌拍干，每孔加鄰苯二胺100 μL，37 ℃顯色15 min，每孔加50 μL終止液（2 mol/L H2SO4），最后在492 nm波長處測定OD值。

致敏性消減率/%=（陽性對照OD492nm－消減樣品OD492nm）/陽性對照OD492nm×100

式中：陽性對照為未處理蝦仁過敏原蛋白與過敏者血清反應(yīng)的OD492nm值；消減樣品OD492nm值為處理后的樣品過敏原蛋白與過敏者血清反應(yīng)的OD492nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓對蝦仁中過敏原消減效果

2.1.1 高壓對蝦仁中過敏原消減單因素試驗

表1 不同條件下高壓處理蝦仁的致敏性變化（x±s=4）Table 1 Changes in allergenicity of shelled fresh shrimp after high static pressure treatment under different conditions (x±s, = 4)

由表1可知，在上述條件下，處理后的蝦仁蛋白與抗體反應(yīng)的OD492nm值較陽性對照的OD492nm值都有所降低。當(dāng)作用溫度和保壓時間一定（30 ℃，30 min），隨著壓力的增大（100～500 MPa），致敏性消減逐漸降低；壓力和保壓時間一定（300 MPa，30 min）時，隨著溫度的升高（20～50 ℃），致敏性消減逐漸降低；壓力和溫度（300 MPa，30 ℃）一定，保壓時間不同（10～50 min），在20～30 min范圍內(nèi)較好。另外，從表1可以看出，其致敏性消減效果與各種條件下蛋白溶出量有關(guān)，溶出量多，致敏性消減效果好。從溶出蛋白與抗體反應(yīng)的OD值來看，與處理后蝦仁蛋白致敏消減無明顯相關(guān)性。因此，在上述條件下，蝦仁致敏性消減與高壓作用過程蛋白的溶出有關(guān)。

對于溶出蛋白，在3 0 0 M P a條件下高溫（40～50 ℃）或長時間（50 min）處理，有利于其致敏性的消減，其消減效果與蛋白溶出量無關(guān)。

2.1.2 高壓法對蝦仁中過敏原消減條件優(yōu)化

由表2可知，通過高壓處理后的蝦仁，其蛋白經(jīng)ELISA檢測，得出3種因素對OD492nm值的影響大小依次為A＞B＞C，即壓力＞溫度＞保壓時間，較好的試驗方案為A1B2C1，即壓力100 MPa、溫度25 ℃、保壓時間15 min，經(jīng)過驗證，此條件下處理產(chǎn)物與抗體反應(yīng)的OD492nm值為0.192 5，致敏性消減67.09%。該值雖不在正常人血清與抗體反應(yīng)的OD492nm值范圍（0.03～0.05）內(nèi)，但與未處理的蝦仁蛋白的陽性對照相比（血清反應(yīng)OD492nm值0.585 0±0.014 2），已經(jīng)有很大程度的降低，說明超高壓技術(shù)對蝦仁中過敏原的消減起到了一定的作用。另外，在所選擇的條件范圍內(nèi)，其蝦仁在各條件下致敏性的消減與其蛋白的溶出量高度一致，因此，在300 MPa以下處理蝦仁，其致敏性消減與各條件下蝦蛋白溶出相關(guān)。

表2 高壓消減蝦仁中過敏原條件優(yōu)化 (x±s,= 4）Table 2 Optimization of high static pressure treatment conditions for shelled fresh shrimp (x±s, = 4）

從溶出蛋白的致敏性消減效果來看，較好的處理條件為壓力為200 MPa、溫度30 ℃、保壓時間20 min，其消減效果與溶出蛋白的量無關(guān)。

根據(jù)表2的結(jié)果，單一采用高壓法處理蝦仁，過高的壓力并不能很好地消減過敏原，其原因比較復(fù)雜。1）作為整體蝦仁，在高壓作用下，會引起蛋白質(zhì)二級以上結(jié)構(gòu)的變化[26-27]，導(dǎo)致過敏原的空間表位會發(fā)生變化，從而使其致敏性的降低或升高；2）在高壓處理過程中，蝦仁中的可溶性蛋白（包括過敏原蛋白）會向鹽溶液中滲透[28]，滲透的多少，也會影響蝦仁的致敏性；3）高壓處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，從而發(fā)生溶解性能的變化，影響蛋白質(zhì)向鹽溶液滲透；4）高壓下過敏原蛋白會與蝦仁組織的其他成分作用，也會影響致敏性的變化。從消減效果看，對于蝦仁，其溶出蛋白的量對消減效果致敏性消減影響較大；對溶出蛋白，適當(dāng)?shù)奶幚項l件對致敏性消減影響較大，但與溶出量無關(guān)。

采用高壓處理蝦仁，其本質(zhì)是物理作用，只能改變蛋白的二級以上結(jié)構(gòu)，而不能改變其一級結(jié)構(gòu)。因此，單獨(dú)高壓處理蝦仁或蛋白，只能作用其空間表位，而不能改變其線性表位。要進(jìn)一步提高蝦仁致敏性的消減效果，可采用高壓結(jié)合酶的處理方式，在消減空間表位的同時，通過選擇合適的蛋白酶，水解過敏原蛋白，進(jìn)一步消減線性表位。

2.2 高壓結(jié)合酶法對蝦仁中過敏原消減效果的影響

2.2.1 高壓結(jié)合酶法在不同條件下對蝦仁中過敏原消減作用

表3 不同條件下高壓結(jié)合酶法處理蝦仁的致敏性變化 (x±s, = 4）Table 3 Change in allergenicity of shelled fresh shrimp after high static pressure in combination with enzyme treatment under different conditions (x±s, = 4）

根據(jù)方法1.3.3.1節(jié)進(jìn)行試驗，結(jié)果見表3。在作用溫度和時間（30 ℃、30 min）一定時，500 MPa處理蝦仁，其致敏性消減75.16% ；當(dāng)壓力和作用時間（300 MPa，30 min）一定時，50 ℃處理蝦仁，蛋白致敏性消減74.87%；當(dāng)壓力和溫度（300 MPa，30 ℃）一定時，處理50 min，蝦仁蛋白致敏性降低70.60%。由上述結(jié)果可以看出，在酶的參與下，在所選擇的條件范圍內(nèi)，高壓、高溫、長時間處理蝦仁，有利于蝦仁蛋白致敏性的消減。

與表1中的結(jié)果相比，蝦仁及溶出蛋白的致敏性均有顯著降低。但蝦仁致敏性消減效果，與蛋白溶出量無關(guān)。另外，由于蛋白酶的加入，影響了高壓處理條件下蛋白質(zhì)的溶出，其原因可能是蛋白酶的加入改變了鹽溶液中溶質(zhì)的濃度。

從表3中蝦仁致敏性消減效果可以推測，蝦仁內(nèi)部過敏原蛋白的消減，可能是由于蛋白酶作用的結(jié)果，即蛋白酶可滲透蝦仁內(nèi)部發(fā)揮作用。從溶出蛋白的消減效果可以看出，在300 MPa、40 ℃、30 min的處理條件，其血清反應(yīng)的OD492nm值接近正常人血清反應(yīng)值范圍（0.03～0.05），溶出的蛋白消減了90.9%，這說明在該條件下，其酶活影響較小[16]。

2.2.2 高壓結(jié)合酶法消減蝦仁中過敏原的條件優(yōu)化

根據(jù)方法1.3.3.2節(jié)所設(shè)計的條件進(jìn)行正交試驗，其結(jié)果見表4。

表4 高壓結(jié)合酶法消減蝦仁過敏原條件優(yōu)化 (x±s,= 4）Table 4 Optimization of conditions for reducing the allergenicity of shelled fresh shrimp by high static pressure in combination with enzyme treatment (x±s, = 4）

由表4可知，通過高壓結(jié)合酶法處理后的蝦仁，4種因素的影響大小依次為A＞B＞C＞D，即壓力＞溫度＞保壓時間＞酶與蝦仁質(zhì)量比，較好的試驗方案為A2B2C1D1，即壓力為450 MPa、溫度40 ℃、保壓時間55 min、酶與蝦仁質(zhì)量比1∶130，經(jīng)過驗證實驗，此條件下的產(chǎn)物與抗體反應(yīng)的OD492nm值為0.084，致敏性消減85.64%。出現(xiàn)上述結(jié)果可能有以下幾方面的原因：1）超高壓能夠破壞蝦仁中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[26-27]，使過敏原的空間表位被掩蓋或者破壞；2）高壓能夠使蝦仁中的過敏原蛋白變性，有利于酶的作用；另外，蝦仁中蛋白質(zhì)的溶出更有利于酶的作用（表3）；3）高壓也能夠使酶滲入蝦仁內(nèi)部，從而水解蝦仁內(nèi)部的過敏原蛋白；4）高壓能夠影響酶的活性，但在所選擇的的條件范圍內(nèi)，酶活損失較小[16]。

2.2.3 鹽水質(zhì)量濃度對蝦仁中過敏原致敏性消減效果的影響

將蝦仁（10g）分別加入0.85、1.0、1.25、1.5 g/100 mL的鹽水（40 mL、pH 6.5），按照酶與蝦仁的質(zhì)量比1∶130加入木瓜蛋白酶，裝袋、真空密封后，再利用高壓結(jié)合酶法對蝦仁進(jìn)行處理（條件為壓力450 MPa、溫度40 ℃、保壓時間55 min），結(jié)果見表5。

表5 鹽水質(zhì)量濃度對蝦仁中過敏原消減效果的影響 (x±s, = 4）Table 5 Effect of salt solution concentration on reducing the allergenicity of shelled fresh shrimp (x±s, = 4）

由表5可知，鹽水的質(zhì)量濃度對蝦仁中過敏原的消減效果有一定的影響，與0.85 g/100 mL的鹽水質(zhì)量濃度相比，1.0 g/100 mL更有助于蝦仁致敏性的消減，其致敏性消減86.58%。因此，按照蝦仁與鹽水（質(zhì)量濃度1 g/100 mL，pH 6.5）質(zhì)量比1∶4，酶與蝦仁的質(zhì)量比為1∶130加入木瓜蛋白酶，裝袋，真空密封；在壓力450 MPa、溫度40 ℃、保壓時間55 min的條件進(jìn)行處理，可獲較好的消減效果。

3 結(jié) 論

利用超高壓法和高壓結(jié)合酶法處理蝦仁對其致敏性具有較好的消減作用。單一采用超高壓處理，蝦仁致敏性消減效果與處理過程中蝦仁蛋白二級以上結(jié)構(gòu)變化及蛋白溶出量有關(guān)，其作用只會影響過敏原空間表位；采用高壓結(jié)合酶法處理效果好于單獨(dú)采用高壓處理法，但影響因素要比較復(fù)雜，適當(dāng)調(diào)整各種因素（壓力、溫度、時間、酶與蝦仁質(zhì)量比、鹽水質(zhì)量濃度、蝦仁與鹽溶液比例），都會影響蝦仁蛋白致敏性的消減作用，其作用不僅影響過敏原蛋白的空間表位，同時會破壞其線性表位，致敏性消減效果更好。

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Reducing Allergenicity of Penaeus vannamei Shelled Fresh Shrimp by High Static Pressure in Combination with Enzyme Treatment

ZHANG Yue, HU Zhi-he*, XIE Dan-dan, WU Zi-jian, XUE Lu, LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

This study examined the effects of high static pressure in combination with enzymatic digestion on reducing the allergenicity of fresh shrimp (Penaeus vannamei). The fresh shrimp was treated by high static pressure in combination with enzymatic digestion after the head, tail, shell, and catgut were removed. Indirect enzyme-link immunosorbent assay was used to e valuate its allergenicity-reducing effect under established experimental conditions. Results showed that when shelled fresh shrimp was treated at 100 MPa for 15 min at 25 ℃, the allergenicity was reduced by 67.09%, and this effect was related to the quantity of dissolved protein. When shelled fresh shrimp was soaked in 1 g/100 mL salt solution, digested with papain at a ratio 1:130 of papain to shrimp, vacuumed, and then treated at 450 MPa for 55 min at 40 ℃, the allergenicity was reduced by 86.58%. These results showed that the allergenicity of shelled fresh shrimp could be reduced by high static pressure treatment, and a superior effect was achieved by combination with enzyme digestion.

Penaeus vannamei; highstatic pressure in combination with enzyme treatment; papain; reducing allergenicity

TS201.6

A

1002-6630（2014）04-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201404002

2013-07-16

國家自然科學(xué)基金面上項目（31271841）

張悅（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：moyouyouyy@126.com

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn