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    丹皮酚對結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

    2014-01-18 03:10:12譚詩云
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年7期
    關(guān)鍵詞:丹皮結(jié)腸癌誘導(dǎo)

    李 明 譚詩云

    武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北武漢 430060

    研究表明,非甾體類消炎藥(non-steroid anti-in-flammatory drugs,NSAIDs)能降低結(jié)腸癌的發(fā)生,減少家族性結(jié)腸息肉患者息肉數(shù)量和大小,并能預(yù)防結(jié)腸腺瘤的復(fù)發(fā)[1]。本室前期研究顯示[2]乙酰水楊酸能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)而抑制生長,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 但臨床研究表明長期應(yīng)用NSAIDs可引起胃潰瘍甚至胃出血及一系列心血管不良反應(yīng),限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。 因此尋找毒性小,而又能有效的抑制COX-2 的抑制劑, 是大腸癌化學(xué)預(yù)防的重要課題。

    丹皮酚具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用,包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等,且其副作用小。 課題組前期[3-5]觀察了丹皮酚對大腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響,發(fā)現(xiàn)丹皮酚可抑制大腸癌細(xì)胞的增殖生長, 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因如Bcl-2、Bax、Fas 及p53 等的表達(dá),且丹皮酚能夠影響腫瘤細(xì)胞的生長周期,并與5-Fu 具有協(xié)同作用。丹皮酚與非甾體類抗炎藥均能有效下調(diào)COX-2 的表達(dá)量, 從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了丹皮酚對人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及RUNX-3 基因的影響。

    1 資料與方法

    1.1 細(xì)胞及試劑

    人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; 丹皮酚注射液購于寧波天真制藥有限公司,純度≥99.9%;AnnexinV/PI 試劑盒購于BENDER 公司;CCK-8 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基、DEPC 購于杭州四季青生物材料研究所;Fluo-3/AM 購于日本同仁化學(xué)研究所;Trizol 試劑、DEPC、異丙醇、氯仿、RT-PCR 試劑盒等購于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司;RUNX-3 單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司;辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG 購自武漢博士德生物科技有限公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    LoVo 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中,置于37℃,飽和濕度,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2~3 天傳代1 次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

    1.3 CCK-8 比色法檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞活力的影響

    取對數(shù)生長期的LoVo 細(xì)胞,以5×104/mL 的濃度接種于96 孔板,每孔200 μL,待細(xì)胞貼壁后分組,丹皮酚組加入丹皮酚終濃度分別為15.63、31.25、62.50、125、250 mg/L 的培養(yǎng)液,對照組加入等量的培養(yǎng)液。 每組設(shè)5 個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72、96 h,實驗終止前2 h 每孔加入CKK-8 試劑20 μL,孵育2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光值,即A 值,細(xì)胞存活率=處理組A 值/對照組A 值×100%。

    1.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察

    取對數(shù)生長期LoVo 細(xì)胞消化傳代并培養(yǎng)24 h后,換丹皮酚終濃度為15.63~250 mg/L 的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

    1.5 流式細(xì)胞儀檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞凋亡率的影響

    取對數(shù)生長期的LoVo 細(xì)胞, 以1×106/mL 濃度接種于6 孔培養(yǎng)板中, 貼壁后分為實驗組和對照組,實驗組分別加入含丹皮酚(終濃度為31.25、62.50、125 mg/L)的培養(yǎng)液,對照組加入等量培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,離心、洗滌、固定后加入AnnexinV-FITC和PI 染色。 篩網(wǎng)過濾送流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

    取對數(shù)生長期的LoVo 細(xì)胞,以1×106/mL 接種于特制培養(yǎng)皿中,分組及處理同上,培養(yǎng)48 h 后,HBSS液洗滌3 次, 加入濃度為5 μmol/L 的Fluo-3/AM 工作液300 μL,孵育60 min,用HBSS 液洗滌3 次,加入HBSS 液覆蓋細(xì)胞,孵育30 min。 置于激光掃描共聚焦顯微鏡上檢測,隨機(jī)選取5 個視野(放大100倍),每個視野隨機(jī)選取7 個細(xì)胞,利用隨機(jī)軟件測定其熒光強(qiáng)度。 其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度成正相關(guān),可準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

    1.7 RT-PCR 法檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞RUNX-3 mRNA 的影響

    細(xì)胞接種及分組同上,培養(yǎng)48 h 后,收集細(xì)胞,按Trizol 試劑說明書一步法提取總RNA, 計算出RNA 濃度,按RT 試劑盒操作說明合成cDNA,并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。 PCR 反應(yīng)條件:94℃4min;94℃30 s,51℃30 s,72℃25 s;30 cycles,72℃4 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳, 紫外光下觀察并拍照。 RT-PCR 采用的β-actin 及RUNX3引物由南京金瑞斯合成,RUNX3 上游引物為5'-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3',下游引物為5'-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3',β-actin 上游引物為5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3', 下游引物為5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3', 擴(kuò)增片段長度分別為179 bp 和240 bp,β-actin 為內(nèi)參。

    1.8 Western blot 檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞RUNX-3蛋白表達(dá)的影響

    細(xì)胞接種及分組同上,收集細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,參照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作,提取細(xì)胞總蛋白,并測定蛋白濃度,蛋白樣品加入1/5 體積的5×上樣緩沖液,沸水煮沸5 min 后離心,以每孔20 μg/孔上樣,行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 加入1∶1000 稀釋的兔抗人RUNX-3 蛋白,4℃過夜,β-actin 作為內(nèi)參,TBST 洗膜3 次,加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG,室溫孵育2 h,同樣洗膜3 次,ECL 顯色,觀察各條帶深淺變化。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析, 兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞活力的影響

    丹皮酚在15.63~250 mg/L 濃度范圍內(nèi)均能有效降低結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的生存率,在相同處理時間,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞生存率逐漸降低;同一藥物濃度,隨著作用時間的延長,細(xì)胞生存率也逐漸降低,即呈顯著的劑量和時間依賴效應(yīng), 與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05)。 見圖1。

    圖1 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞增殖的影響(n = 5)

    2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

    倒置顯微鏡下可見對照組細(xì)胞生長旺盛,折光率較高,胞體大,形態(tài)成梭形或多邊形,胞質(zhì)均勻透明,隨培養(yǎng)時間延長變化不大。 實驗組細(xì)胞增殖減慢,且隨著丹皮酚濃度的增大和作用時間的延長,細(xì)胞逐漸變小、變圓,折光率減弱,核濃縮等,部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中,但細(xì)胞膜完整,最后裂解。 丹皮酚濃度越高,作用時間越長,上述表現(xiàn)越明顯,漂浮細(xì)胞越多。

    250 mg/L 丹皮酚組可見大量懸浮的細(xì)胞碎片。

    2.3 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞凋亡率的影響

    流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,丹皮酚濃度為0 mg/L時,細(xì)胞凋亡率為(2.3±0.9)%;丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 作用 細(xì)胞48 h 后, 凋亡率分別為(12.3±1.3)%、(22.4±1.5)%、(36.2±2.1)%, 與對照組[(2.3±0.9)%]比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05),表明丹皮酚能誘導(dǎo)LoVo 細(xì)胞凋亡。 見圖2。

    2.4 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的影響

    圖2 丹皮酚對細(xì)胞凋亡率的影響

    鈣離子熒光劑Fluo-3/AM 能特異性與Ca2+結(jié)合,本研究所測的熒光強(qiáng)度反映的是細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的相對水平,并不代表實際細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。 如圖3 所示, 丹皮酚作用后人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。 圖像分析結(jié)果顯示,對照組(丹皮酚濃度為0 mg/L)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度為 (24.45±3.74), 丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 時作用LoVo 細(xì)胞48 h 后,熒光強(qiáng)度分別為(41.36±4.62),(57.51±3.83)和(69.43±3.76);丹皮酚組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。 見圖3。

    2.5 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞RUNX-3 mRNA 表達(dá)的影響

    瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,RUNX-3 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為179 bp, 內(nèi)參β-actin 條帶為240 bp,與所設(shè)計的片段大小一致, 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h 后,RUNX-3 基因的表達(dá)均上調(diào),且隨藥物濃度的升高,LoVo 細(xì)胞RUNX-3 基因的表達(dá)量亦升高,呈明顯劑量依賴效應(yīng)。 見圖4。

    2.6 丹皮酚對RUNX-3 蛋白表達(dá)的影響

    丹皮酚處理LoVo 細(xì)胞48 h 后,結(jié)果顯示隨著丹皮酚濃度的升高,RUNX-3 蛋白表達(dá)量也逐漸升高。見圖5。

    3 討論

    細(xì)胞凋亡是維持多細(xì)胞機(jī)體平衡的一個重要生理機(jī)制,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的平衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6],細(xì)胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程,通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。 有研究證實,丹皮酚在體內(nèi)外均能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn),丹皮酚在15.63~250 mg/L 濃度范圍,對人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的增殖均有抑制作用, 隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長,抑制細(xì)胞增殖的作用亦逐步增強(qiáng),呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)及時間效應(yīng)關(guān)系。 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞后, 在倒置顯微鏡下均可見到凋亡細(xì)胞的形態(tài);流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高, 呈明顯的劑量依賴效應(yīng), 表明丹皮酚可抑制結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

    圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測丹皮酚對LoVo [Ca2+]i 的影響

    圖4 丹皮酚對LoVo 細(xì)胞RUNX3 mRNA 表達(dá)的影響

    圖5 Western blot 檢測丹皮酚對LoVo 細(xì)胞RUNX3 蛋白表達(dá)的影響

    細(xì)胞內(nèi)Ca2+廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動及凋亡等病理生理過程[9],鈣離子在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用已經(jīng)有大量實驗證實[10],研究顯示,在細(xì)胞凋亡早期和晚期階段細(xì)胞內(nèi)Ca2+均增加, 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的啟動環(huán)節(jié)[11]。 本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚處理后,LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng),且隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng),呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,與對照組比較,有顯著差異性(P < 0.05)。LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加與細(xì)胞凋亡率呈平行關(guān)系, 且這種效應(yīng)隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。 提示LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增多與藥物作用有關(guān),表明Ca2+升高在丹皮酚抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制中可能起重要作用,提示調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡可能是其作用機(jī)制之一。 因此,增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量可能成為結(jié)腸癌治療的一個作用靶點(diǎn)。 丹皮酚具體參與Ca2+通道運(yùn)輸系統(tǒng)的調(diào)控及丹皮酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路還需進(jìn)一步研究。

    此外,本研究還發(fā)現(xiàn),丹皮酚能上調(diào)LoVo 細(xì)胞中人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human runt-related transcription factor 3,RUNX3)基因表達(dá),且表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而增加,呈明顯濃度效應(yīng)。大量研究證明,轉(zhuǎn)錄生長因子-β (transforming growth factor,TGF-β)和Wnt 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[12-13]。 RUNX3 參與TGF-β 信號通路誘導(dǎo)生長抑制的過程[14]。 研究證實,RUNX3 基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)甚至缺失,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15-16]。有證據(jù)表明,恢復(fù)RUNX3 基因的表達(dá)能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及下調(diào)cyclin D1 的表達(dá)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),丹皮酚能抑制腫瘤細(xì)胞向G1期行進(jìn)和G1/S 轉(zhuǎn)換 (結(jié)果待發(fā))。 并且RUNX3 基因表達(dá)上調(diào)趨勢與流式細(xì)胞儀檢測的凋亡率增升高趨勢是一致的。 因此,推測丹皮酚能通過上調(diào)RUNX3 基因表達(dá)影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

    本研究還發(fā)現(xiàn), 經(jīng)丹皮酚處理后,LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因表達(dá)均升高, 即丹皮酚一方面能增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量, 另一方面又能促進(jìn)RUNX3 基因表達(dá), 表明兩者可能處于同一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。 研究表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加參與包括基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種生物反應(yīng)過程[19-20],提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因相互協(xié)調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。丹皮酚能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及上調(diào)RUNX3 基因的表達(dá)。 由此推測,丹皮酚和阿司匹林可能通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量, 上調(diào)LoVo 細(xì)胞RUNX3 基因的表達(dá),恢復(fù)了TGF-β 信號通路生理功能,并抑制了Wnt 信號通路,抑制LoVo 細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

    腫瘤的凋亡是一個復(fù)雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),Ca2+含量與RUNX3 基因之間相關(guān)信號通道,是下一步要進(jìn)行的工作。

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