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    激活態(tài)雪旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化作用的研究

    2014-01-18 03:10:12趙承斌
    關(guān)鍵詞:陽(yáng)性細(xì)胞干細(xì)胞分化

    張 睿 張 軍 趙承斌

    哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科,黑龍江哈爾濱 150086

    周圍神經(jīng)損傷是骨科常見(jiàn)的疾病之一,雖然周圍神經(jīng)具有一定的再生能力,但對(duì)于較大缺損卻很難自身修復(fù)[1]。隨著組織工程學(xué)領(lǐng)域研究的深入,神經(jīng)干細(xì)胞 (NSCs) 已被公認(rèn)為是對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的有效方法,通過(guò)NSCs 在神經(jīng)斷端的不斷分化,使受損的周圍神經(jīng)重新恢復(fù)連接。然而單純形態(tài)學(xué)得連接不能保證神經(jīng)的傳導(dǎo)功能,有研究表明,這與NSCs 分化過(guò)程中分化為膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的比例有關(guān)[2],提高神經(jīng)元的分化比例,降低膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)可有效提高神經(jīng)的傳導(dǎo)速度,因此許多學(xué)者通過(guò)不同方法促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化[3-5],均取得了一定進(jìn)展。 本研究通過(guò)激活態(tài)雪旺細(xì)胞(SCs)刺激NSCs 的分化,觀察其誘導(dǎo)NSCs 分化為神經(jīng)元的能力。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    雌性SD 大鼠[中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供,許可證號(hào):SYXK(黑)2006-032];DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone 公司,美國(guó));青-鏈雙抗,胰蛋白酶,Ⅱ型膠原酶 (碧云天, 中國(guó)); 兔抗鼠單克隆抗體Nestin,F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG,兔抗鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)單克隆抗體,兔抗鼠MAP-2、GFAP 單克隆抗體(武漢博士德公司);Transwell 培養(yǎng)皿(Corning 公司,美國(guó))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 取出生24 h 內(nèi)的SD 大鼠,斷髓處死后無(wú)菌條件下取出脊髓,顯微鏡下剝離硬脊膜,剪成5 mm3組織塊,加入0.25%胰酶消化10 min,用吸管反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液,加入5 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。 1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入含20 ng/mL 的EGF 和20 ng/mL的DMEM/F12 培養(yǎng)液,重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每6~8 天傳代1次,連續(xù)傳4 代。 取第4 代神經(jīng)球,移入含有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6 孔板內(nèi),24 h 后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定,加入兔抗鼠Nestin(1∶100)單克隆抗體作為一抗,4℃過(guò)夜,加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔二抗,孵育30 min,進(jìn)行觀察。

    1.2.2 雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取體重(100±5)g 的SD大鼠,10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉后,以右側(cè)臀大肌為中心消毒, 鋪無(wú)菌孔巾, 縱行做一長(zhǎng)約1.5 cm 切口,分離暴露坐骨神經(jīng),于近端結(jié)扎,逐層縫合。 1 周后,處死大鼠,分離雙側(cè)坐骨神經(jīng),右側(cè)坐骨神經(jīng)由于結(jié)扎變性,SCs 受刺激而發(fā)生激活, 稱激活態(tài)SCs;左側(cè)為正常坐骨神經(jīng),提取的SCs 稱為普通SCs。 雙側(cè)坐骨神經(jīng)均剪成5 mm 小段, 加入0.1%胰蛋白酶和0.25%的Ⅱ型膠原酶消化1 h, 反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液,加入5 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。 采用差速貼壁法,使成纖維細(xì)胞貼壁,未貼壁細(xì)胞移入含20 ng/mL EGF 和20 ng/mL 的DMEM/F12 培 養(yǎng)液中行原代培養(yǎng)。

    1.2.3 細(xì)胞的分組與聯(lián)合培養(yǎng) 將細(xì)胞隨機(jī)分為3 組,A 組為激活態(tài)SCs 與NSCs 聯(lián)合培養(yǎng),B 組為普通SCs 與NSCs 聯(lián)合培養(yǎng),C 組NSCs 單獨(dú)培養(yǎng), 作為對(duì)照。 細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)采用0.2 μm 的6 孔Transwell 培養(yǎng)皿,上室為SCs,下室為NSCs。 培養(yǎng)基采用不含任何營(yíng)養(yǎng)因子的DMEM/F12 培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第2、4、6天分別對(duì)下室細(xì)胞行MTT 染色,檢測(cè)細(xì)胞活性。

    1.2.4 Western blot 檢測(cè)激活態(tài)雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平 聯(lián)合培養(yǎng)1 周后, 取A、B 兩組上室細(xì)胞,提取總蛋白,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入兔抗鼠EGF(1∶100)、bFGF(1∶200)單克隆抗體,4℃過(guò)夜,加入AP 顯色液顯色。 用Image-ProPlus 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化的免疫熒光檢測(cè) 聯(lián)合培養(yǎng)1周后,將多聚賴氨酸包被的蓋玻片放入下室,24 h 后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定, 分別加入兔抗鼠MAP-2(1∶200)、GFAP(1∶200)單克隆抗體作為一抗,4℃過(guò)夜,加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗(1∶200),室溫孵育30 min。 在100 倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)不同視野, 計(jì)數(shù)抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與全部細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在全部細(xì)胞中的比值,公式為:陽(yáng)性細(xì)胞比值=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用方差分析, 兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

    NSCs 在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)懸浮生長(zhǎng),呈圓形,核較大,折光性強(qiáng)。于培養(yǎng)第5 天開(kāi)始聚集成團(tuán),呈球樣生長(zhǎng),第7 天左右可見(jiàn)部分神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁, 并發(fā)出短小突起。傳4 代后,NSCs 形態(tài)穩(wěn)定,未見(jiàn)異型性改變。熒光染色可見(jiàn)聚集成球的NSCs 發(fā)出綠色熒光,可見(jiàn)因貼壁而發(fā)出的短促突起。

    2.2 激活態(tài)雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng)

    結(jié)扎SD 大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)后,大鼠出現(xiàn)右下肢跛行,1 周后有足部有潰瘍形成。 分離雙側(cè)坐骨神經(jīng),可見(jiàn)結(jié)扎遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)明顯較對(duì)側(cè)增粗。細(xì)胞經(jīng)差速貼壁以后可見(jiàn)胞體較大的成纖維細(xì)胞得以去除,去除后細(xì)胞呈梭形,3 d 后,胞體增長(zhǎng),發(fā)出突起,至7 d 細(xì)胞大量增殖呈旋渦狀排列,激活態(tài)SCs 生長(zhǎng)速度較普通SCs 的生長(zhǎng)速度快。

    2.3 各組神經(jīng)干細(xì)胞的分化狀態(tài)

    A 組NSCs 在培養(yǎng)5 d 后即開(kāi)始發(fā)出較長(zhǎng)突起,出現(xiàn)貼壁細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)增長(zhǎng),細(xì)胞間借突起形成網(wǎng)狀連接。 B 組細(xì)胞在8 d 后開(kāi)始出現(xiàn)分化,但細(xì)胞發(fā)出的突起較A 組短小。 C 組細(xì)胞仍呈球形生長(zhǎng),少見(jiàn)貼壁細(xì)胞。 應(yīng)用MTT 法檢測(cè)三組細(xì)胞的平均光密度值,可見(jiàn)第2、4 天三組細(xì)胞的活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05),第6 天C 組活細(xì)胞比例開(kāi)始降低,A、B 組與C 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.05),A 組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 見(jiàn)圖1。

    圖1 MTT 法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活性的檢測(cè)

    2.4 激活態(tài)雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平

    A、B 兩組上室細(xì)胞提取的蛋白經(jīng)電泳后,條帶清晰,兩組相同蛋白密度有差異,管家基因GAPDH 作為內(nèi)參,電泳條帶亮度一致。應(yīng)用Image-ProPlus 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值,根據(jù)公式:相對(duì)量=產(chǎn)物電泳條帶密度/GAPDH×100%,計(jì)算各組蛋白量,可見(jiàn)A 組細(xì)胞EGF、bFGF 的表達(dá)水平均高于B 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。 見(jiàn)表1。

    表1 雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的平均光密度值(±s)

    表1 雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的平均光密度值(±s)

    注:EGF:表皮生長(zhǎng)因子,bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

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    2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化的免疫熒光檢測(cè)

    對(duì)三組細(xì)胞分別進(jìn)行MAP-2 和GFAP 染色,計(jì)算每高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞的比例。A 組細(xì)胞MAP-2 染色陽(yáng)性率明顯高于B、C 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B 組MAP-2 染色陽(yáng)性率明顯高于C 組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。A 組GFAP 陽(yáng)性率明顯低于B 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);C 組GFAP 陽(yáng)性率明顯低于A、B 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。 見(jiàn)表2。

    表2 免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞在分化細(xì)胞中的比例(%,±s)

    表2 免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞在分化細(xì)胞中的比例(%,±s)

    注:與A 組比較,*P <0.05;與C 組比較,▲P <0.05

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    3 討論

    各種外傷或病變所致的周圍神經(jīng)損傷一直以來(lái)都是顯微外科研究的重點(diǎn)內(nèi)容。雖然周圍神經(jīng)具有自我修復(fù)能力, 但是如果缺損大于10 mm 以上則很難使近端神經(jīng)纖維長(zhǎng)入[6],從而造成永久性的功能喪失。為此有學(xué)者研制出干細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)管支架的技術(shù)[7-10],使得周圍神經(jīng)的斷端得以重連,然而單純的形態(tài)學(xué)重建卻難以恢復(fù)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。 有研究指出NSCs 在體內(nèi)主要分化為膠質(zhì)細(xì)胞,而膠質(zhì)細(xì)胞則會(huì)影響神經(jīng)元的傳導(dǎo)速度[11-12],因此NSCs 如何高效分化出神經(jīng)元就成為研究關(guān)鍵。

    周圍神經(jīng)損傷后, 損傷遠(yuǎn)端軸突發(fā)生華勒變性,繼而壞死溶解,周圍的SCs 此時(shí)會(huì)發(fā)生增殖,一方面吞噬溶解的軸突,另一方面分泌大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)近端軸突的長(zhǎng)入[13-14]。 本研究利用雪旺細(xì)胞這一特點(diǎn),于體外建立SCs,使其持續(xù)分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,誘導(dǎo)NSCs 的分化。有研究指出,NSCs 的生長(zhǎng)分化需要多種營(yíng)養(yǎng)因子的協(xié)同作用[15-16],盡管某一因子的濃度較低,但卻是不可或缺的。 體外添加營(yíng)養(yǎng)因子則難以滿足干細(xì)胞分化的要求[17-18]。 本研究運(yùn)用細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的方式,通過(guò)細(xì)胞間的旁分泌作用,克服這一不足。 同時(shí),應(yīng)用Transwell 培養(yǎng)皿,借助聚碳酸酯膜的作用使細(xì)胞間不發(fā)生接觸,排除了細(xì)胞間的相互干擾。

    本研究的結(jié)果可以看出,與普通SCs 相比,激活態(tài)SCs 對(duì)NSCs 的誘導(dǎo)作用存在時(shí)間短、神經(jīng)元分化率高等優(yōu)點(diǎn)。 但是從MTT 染色可以看出,由于各組只應(yīng)用單純DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng),活細(xì)胞比例隨時(shí)間呈下降趨勢(shì),說(shuō)明單純?cè)隗w外依靠雪旺細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子難以滿足NSCs 的生長(zhǎng)需求,從而解釋了體內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞死亡率高的原因[19-20]。 這就需要進(jìn)一步探索能夠保持體內(nèi)高濃度營(yíng)養(yǎng)因子的方法,從而維持NSCs 的體內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)。

    由于條件限制, 本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足之處,對(duì)SCs 分泌的因子只進(jìn)行了較為重要的EGF 和bFGF的檢測(cè), 如果能檢測(cè)出全部營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平,將有助于進(jìn)一步的詳細(xì)分析。

    綜述所述,激活態(tài)雪旺細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化進(jìn)程,提高神經(jīng)元的分化比例。

    [1] Cheng LN,Duan XH,Zhong XM,et al. Transplanted neural stem cells promote nerve regeneration in acute peripheral nerve traction injury:assessment using MRI [J]. AJR Am J Roentgenol,2011,196(6):1381-1387.

    [2] Chang DJ,Oh SH,Lee N,et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A)migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats [J]. Exp Mol Med,2013,45:53.

    [3] Akama K,Horikoshi T,Nakayama T,et al. Proteomic identification of differentially expressed genes during differentiation of cynomolgus monkey(Macaca fascicularis)embryonic stem cells to astrocyte progenitor cells in vitro [J].Biochim Biophys Acta,2013,1834(2):601-610.

    [4] Stringari C,Nourse JL,F(xiàn)lanagan LA,et al. Phasor fluorescence lifetime microscopy of free and protein -bound NADH reveals neural stem cell differentiation potential[J]. PLoS One,2012,7(11):48014.

    [5] Jha RM,Liu X,Chrenek R,et al.The postnatal human filum terminale is a source of autologous multipotent neurospheres capable of generating motor neurons[J].Neurosurgery,2013,72(1):118-129.

    [6] 李高山.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與施萬(wàn)細(xì)胞聯(lián)合移植對(duì)周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,10(21):90-93.

    [7] Emborg ME,Liu Y,Xi J,et al. Induced pluripotent stem cell-derived neural cells survive and mature in the nonhuman primate brain [J]. Cell Rep,2013,3(3):646-650.

    [8] Heermann S,Motlik K,Hinz U,et al. Glia cell line-derived neurotrophic factor mediates survival of murine sympathetic precursors [J]. J Neurosci Res,2013,91(6):780-785.

    [9] He BL,Ba YC,Wang XY,et al.BDNF expression with functional improvement in transected spinal cord treated with neural stem cells in adult rats [J]. Neuropeptides,2013,47(1):1-7.

    [10] Ishii M,Arias AC,Liu L,et al.A stable cranial neural crest cell line from mouse [J]. Stem Cells Dev,2012,21(17):3069-3080.

    [11] Ortega F,Gascon S,Masserdotti G,et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling [J]. Nat Cell Biol,2013,15(6):602-613.

    [12] Bonner JF,Haas CJ,F(xiàn)ischer I. Preparation of neural stem cells and progenitors:neuronal production and grafting applications [J]. Methods Mol Biol,2013,1078:65-88.

    [13] Lamond R,Barnett SC. Schwann cells but not olfactory ensheathing cells inhibit CNS myelination via the secretion of connective tissue growth factor [J]. J Neurosci,2013,33(47):18686-18697.

    [14] Faulkner SD,Ruff CA,F(xiàn)ehlings MG.The potential for stem cells in cerebral palsy-piecing together the puzzle [J].Semin Pediatr Neurol,2013,20(2):146-153.

    [15] Nitzan E,Pfaltzgraff ER,Labosky PA,et al. Neural crest and Schwann cell progenitor-derived melanocytes are two spatially segregated populations similarly regulated by Foxd3 [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(31):12709-12714.

    [16] Ren YJ,Zhang S,Mi R,et al. Enhanced differentiation of human neural crest stem cells towards the Schwann cell lineage by aligned electrospun fiber matrix [J]. Acta Biomater,2013,9(8):7727-7736.

    [17] Guo X,Spradling S,Stancescu M,et al. Derivation of sensory neurons and neural crest stem cells from human neural progenitor hNP1 [J]. Biomaterials,2013,34(18):4418-4427.

    [18] Xia L,Wan H,Hao SY,et al. Co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells within poly (L-lacticco-glycolic acid) scaffolds facilitates axonal regeneration in hemisected rat spinal cord [J]. Chin Med J(Engl),2013,126(5):909-917.

    [19] Armati PJ,Mathey EK. An update on Schwann cell biology-immunomodulation, neural regulation and other surprises [J]. J Neurol Sci,2013,333(1-2):68-72.

    [20] Guo Z,Wang X,Xiao J,et al. Early postnatal GFAP-expressing cells produce multilineage progeny in cerebrum and astrocytes in cerebellum of adult mice [J]. Brain Res,2013,1532:14-20.

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