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    α 干擾素增強骨肉瘤細胞對依托泊苷敏感性的實驗研究

    2014-01-18 03:09:24黃秀芳原向偉
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年7期
    關(guān)鍵詞:干擾素活化誘導(dǎo)

    黃秀芳 原向偉

    1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科,廣東江門 529030;2.廣東省江門市中心醫(yī)院骨科,廣東江門 529030

    骨肉瘤高發(fā)于青少年人群,居于人類骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第1 位,其惡性程度高,發(fā)展快,許多患者在發(fā)現(xiàn)時已存在肺轉(zhuǎn)移,因此療效不佳。 目前主要治療方法包括新輔助化療+外科手術(shù)包括保肢或截肢手術(shù),但能否手術(shù)及保證手術(shù)效果的重要前提是化療有效。臨床上相當(dāng)患者因為化療耐藥或毒副作用大等問題,引起化療失敗,導(dǎo)致患者無法行保肢手術(shù)從而截肢,甚至無法手術(shù)而導(dǎo)致死亡[1]。 因此,提高化療療效對于骨肉瘤的治療來講具有重大意義。IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素,具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[2],IFN-α 可直接抑制耐藥骨肉瘤細胞的生長[3],然而其對骨肉瘤化療敏感性的影響目前尚不清楚。因此筆者聯(lián)合使用IFN-α 與依托泊苷(Etoposide)處理人骨肉瘤U2OS 和MG63 細胞,探討其對兩種細胞生長抑制和凋亡的影響,并研究其分子機制,以期為提高骨肉瘤對化療藥物敏感性提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞培養(yǎng)

    人骨肉瘤細胞U2OS(p53 基因野生型)和MG63(p53 基因突變型)購自中山大學(xué)病理教研室,培養(yǎng)液為DMEM(GIBCO 產(chǎn)品),其中含10%胎牛血清(GIBCO 產(chǎn)品)、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素,培養(yǎng)于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱(Forma,美國)。

    1.2 藥物處理

    IFN-α 購自Peprotech 公司, 批號300-02A,Etoposide 購自Sigma 公司, 批號E1383, 稀釋分裝凍存-20℃, 使用時采用DMEM 培養(yǎng)液稀釋成工作濃度,處理分為四組:對照組(加入與等量于其余組的DMEM 培養(yǎng)液)、IFN-α (加入含工作濃度藥物的DMEM 培養(yǎng)液使終濃度為5000 U/mL) 組,Etoposide(終濃 度 在U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG63 細 胞 為0.625 μg/mL)組和IFN-α+Etoposide(終濃度同上)組。

    1.3 流式細胞術(shù)檢測

    細胞經(jīng)處理后, 消化離心, 收集細胞;PBS 洗兩次,離心;70%乙醇固定過夜;細胞經(jīng)10 μmol/L 的碘化丙啶(PI)染色5 min,4℃避光30 min;上FCM 流式細胞儀(BD,美國)用488 nm 激發(fā)光檢測細胞DNA含量,LYSIS 軟件分析凋亡率。

    1.4 DNA Ladder 檢測

    細胞經(jīng)各處理后,消化離心,收集細胞;PBS 洗兩次;加入0.8 mL 的DNAzol(Invitrogen 產(chǎn)品,批號:10503-027),室溫放置數(shù)分鐘;4℃離心15 min;將上清移入新EP 管, 加入0.4 mL 的無水乙醇;4℃離心10 min;棄上清,加入75%乙醇洗2 次,加入適量TE 溶解基因組DNA,在含有EB 的1.8%瓊脂糖凝膠電泳(水平電泳槽為北京六一廠產(chǎn)品),紫外線激發(fā),凝膠成像分析儀(Bio-Rad,美國)采集DNA 梯形條帶。

    1.5 Western blot

    收集細胞,PBS 清洗離心,加入蛋白裂解液,定量蛋白(BCA 法),SDS-PAGE 電泳(垂直電泳儀為美國Bio-Rad 產(chǎn)品),然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜(電轉(zhuǎn)儀為美國Bio-Rad 產(chǎn)品),將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST,4℃過夜; 鼠抗人p53、MDM2、Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體和兔抗人PARP 多克隆抗體均為SantaCruz公司產(chǎn)品,稀釋后室溫封膜3 h 或4℃過夜,二抗稀釋后室溫封膜1 h 或4℃過夜, 暗室ECL 化學(xué)發(fā)光,膠片顯影,定影。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 14.0 軟件進行統(tǒng)計分析, 計數(shù)資料以率表示,組間比較采用q 檢驗。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞對Etoposide 引起凋亡的影響

    U2OS 和MG63 細胞經(jīng)IFN-α (5000 U/mL)和etoposide(U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG6 細 胞 為0.625 μg/mL)單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行流式細胞術(shù)檢測凋亡率,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,U20S 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 的細胞凋亡率分別為:(5.1±2.3)%、(5.7±2.7)%、(15.3±3.8)%和(45.5±5.2)%(圖1A),結(jié)果表明IFN-α 單獨并不誘導(dǎo)明顯的U2OS 細胞凋亡,卻明顯增強了Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細胞凋亡,Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。然而同樣處理MG63 細胞后結(jié)果顯示,MG63 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 組的細胞凋亡率分別為:(2.2±0.8)%、(2.5±1.1)%、(23.8±4.6)%和(24.9±5.3)%(圖1B),表明IFN-α 不僅單獨不誘導(dǎo)明顯的MG63 細胞凋亡, 也無增強Etoposide 誘導(dǎo)的MG63 細胞凋亡的作用,Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。

    圖1 流式細胞術(shù)檢測α 干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63細胞凋亡的影響

    2.2 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞中對“DNA 梯形條帶”的影響

    U2OS 和MG63 細胞經(jīng)IFN-α (5000 U/mL)和etoposide (U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL,MG6 細 胞 為0.625 μg/mL)單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行DNA Ladder 電泳。 DNA Ladder 是凋亡的特征性表現(xiàn),結(jié)果顯示, 與其他各組相比,IFN-α/Etoposide 組的U20S 細胞出現(xiàn)明顯的梯形條帶(圖2A);而在MG63 細胞,各組均未出現(xiàn)明顯梯形條帶(圖2B)。 表明IFN-α 可明顯增強Etoposide 誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞凋亡, 并且這種效應(yīng)僅出現(xiàn)在p53 功能正常的U2OS 細胞中,而在因突變導(dǎo)致p53 功能喪失的MG63 細胞中無此效應(yīng),提示了p53 可能參與此效應(yīng)。

    圖2 DNA 梯形條帶分析α 干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63 細胞凋亡的影響

    2.3 IFN-α 在U2OS 細胞中對Etoposide 引起PARP活化的影響

    U2OS 細胞經(jīng)IFN-α (5000 U/mL) 和etoposide(2.5 μg/mL)單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行western blot檢測PARP 蛋白活化。 采用Western blot 法檢測凋亡關(guān)鍵酶PARP 的裂解,結(jié)果表明,在U2OS 細胞,對照組、IFN-α 組和Etoposide 組均未出現(xiàn)PARP 的活化,在聯(lián)合用藥組可見116 KD 的無活性PARP 前體明顯裂解為85 KD 的活化片段(圖3)。提示聯(lián)合用藥明顯增強PARP 活化,從而觸發(fā)U2OS 細胞凋亡。

    圖3 α 干擾素在U2OS 細胞中增強依托泊苷誘導(dǎo)的PARP 裂解活化(Western blot 法)

    2.4 IFN-α 對Etoposide 活化p53 凋亡通路的影響

    為進一步驗證IFN-α 對Etoposide 的增敏作用與野生型p53 的功能有關(guān),筆者進一步檢測了p53 凋亡通路相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2、Mdm2 等的表達。如圖4所示, 在U2OS 細胞中,IFN-α 單獨對p53 及其靶基因MDM2 的表達無明顯影響, 而Etoposide 可明顯增強二者的表達, 聯(lián)合用藥則進一步增高二者的表達。Bax 和Bcl-2 均是p53 的下游調(diào)控基因, 促凋亡的Bax 的表達被Etoposide 增高, 并被IFN-α+Etoposide進一步增強;與對照組相比,抗凋亡的Bcl-2 的表達雖然在Etoposide 組無變化,卻被聯(lián)合用藥明顯減弱。因此p53、Bax、MDM2 和Bcl-2 的表達變化與凋亡保持同步, 提示了在IFN-α 通過激活p53 凋亡通路增強Etoposide 誘導(dǎo)U2OS 細胞凋亡。 然而在MG63 細胞中,上述基因的蛋白表達均無明顯變化,與MG63細胞中的陰性結(jié)果相符合。

    圖4 IFN-α 在U2OS、MG63 細胞中對Etoposide 誘導(dǎo)p53,Bax,Mdm2 和Bcl-2 表達的影響(Western blot 法)

    3 討論

    干擾素是一類多功能細胞因子, 具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[1],包括Ⅰ型和Ⅱ型, 其中IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素, 可與細胞表面的IFN-α/β 受體結(jié)合, 從而引起JAK1 和TYK 的活化,活化的JAK1 和TYK 可分別使STAT1 發(fā)生和酪氨酸位點(Tyr701)和絲氨酸位點(Ser727)的磷酸化,磷酸化的STAT1 蛋白形成同源或異源二聚體, 進入細胞核與其靶基因啟動子上的干擾素刺激反應(yīng)元件或者γ 活化序列結(jié)合,進而調(diào)控下游基因表達[4]。 IFN-α 也是臨床治療腫瘤的第一種細胞因子, 已用于膀胱癌、腎癌、肝癌、白血病的臨床治療[5]。

    以依托泊苷、阿霉素、順鉑等DNA 損傷性藥物為代表的傳統(tǒng)化療藥物已廣泛用于人類骨肉瘤的新輔助化療,并獲得一定療效,但因其無腫瘤靶向特異性,常常在殺滅腫瘤細胞的同時也破壞正常組織細胞,從而帶來嚴(yán)重的毒副作用,最終導(dǎo)致化療的失敗并影響骨肉瘤的最終療效[6-7]。 有研究表明IFN-α 本身即可抑制多藥耐藥的骨肉瘤細胞生長[3],那么IFN-α 聯(lián)合化療藥物對骨肉瘤細胞的生長是否存在協(xié)同作用,筆者對此進行了一系列研究。

    CAD(caspase activated DNAase)是細胞中一種能切割染色質(zhì)的核酸酶, 可被caspase-3 激活,CAD 可識別DNA 序列中的特定位點,將細胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷,從而形成180~200 bp或其整數(shù)倍大小的寡核苷酸片段, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會出現(xiàn)梯形電泳條帶,是凋亡的特征性表現(xiàn),因而成為鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[8]。 筆者從流式細胞術(shù)和形態(tài)學(xué)兩方面證明IFN-α 對U2OS 細胞無明顯影響,卻明顯增強Etoposide 誘導(dǎo)凋亡, 提示二者聯(lián)用比化療藥物單用具有更好的抗癌作用。 并且,在U2OS 細胞中,聯(lián)合用藥可明顯增強PARP[poly(ADP-ribose)polymerase]的活化。實際上,PARP 是反映凋亡的經(jīng)典指標(biāo),受到促凋亡信號的刺激后,細胞內(nèi)蛋白酶Caspases 家族成員caspase 8、9 被激活, 繼而激活下游效應(yīng)性caspase 3,最終裂解其底物PARP 發(fā)生活化,最終導(dǎo)致細胞凋亡[9]。 上述變化在p53 基因突變而喪失功能的MG63 細胞中卻沒有發(fā)生,這提示此效應(yīng)可能與p53 有關(guān)。 p53 是一個經(jīng)典的抑癌基因,在超過50%的惡性腫瘤包括骨肉瘤中都存在缺失或突變, 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10], 作為凋亡調(diào)控的主要靶點, 激活的p53 可通過調(diào)節(jié)其下游基因如MDM2,Bax、Bcl-2 等的轉(zhuǎn)錄和表達,誘導(dǎo)細胞走向凋亡[10]。 目前,p53 已被認為是眾多化療藥物(包括Etoposide)抗癌作用的主要介導(dǎo)者[7]。 不僅如此,最近研究表明,p53 也參與了IFN-α 引發(fā)的信號通路[11]。 筆者發(fā)現(xiàn),Etoposide 激活了p53 及其下游基因如MDM2、Bax 等的表達。 IFN-α 雖然單獨應(yīng)用對p53 通路無明顯影響, 卻明顯增強Etoposide 引起的p53、Bax 和MDM2的表達,同時減弱了Bcl-2 的表達,充分說明IFN-α通過激活p53 依賴性信號通路增強Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細胞凋亡。

    MDM2 基因是調(diào)節(jié)p53 的一個重要因子, 它在細胞核中直接與p53 結(jié)合,抑制其轉(zhuǎn)錄活性,并通過胞核-胞漿穿梭將p53 轉(zhuǎn)運至胞漿并使其降解,從而降低p53 水平;另一方面,p53 的上調(diào)可激活MDM2轉(zhuǎn)錄表達,來反饋性抑制p53 蛋白的繼續(xù)增高。如此二者形成一個負反饋調(diào)節(jié)環(huán), 使細胞內(nèi)MDM2/p53比率保持恒定[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥引起的p53上調(diào)伴隨著MDM2 水平的升高,表明p53 的上調(diào)反饋性地激活了MDM2 的表達,使其水平升高。Bax 和Bcl-2 基因同屬Bcl-2 家族, 均為p53 的靶基因,表達于線粒體,是調(diào)控細胞凋亡的重要基因[13]。二者功能相互拮抗,Bax 具有促進凋亡的作用,Bcl-2 則具有抗凋亡的作用, 二者的比例決定了細胞是否走向凋亡[14-16]。 而聯(lián)合用藥通過激活p53 上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2,使Bax/Bcl-2 比例增高,從而促使細胞發(fā)生凋亡。

    因此,IFN-α 可通過誘導(dǎo)p53 依賴性凋亡來增強骨肉瘤U2OS 細胞對依托泊苷的敏感性,提示IFN-α與骨肉瘤傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可望成為提高骨肉瘤化療療效的新方向。

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