α 干擾素增強骨肉瘤細胞對依托泊苷敏感性的實驗研究

黃秀芳 原向偉

1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫(yī)院骨科，廣東江門 529030

骨肉瘤高發(fā)于青少年人群，居于人類骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第1 位，其惡性程度高，發(fā)展快，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已存在肺轉(zhuǎn)移，因此療效不佳。 目前主要治療方法包括新輔助化療+外科手術(shù)包括保肢或截肢手術(shù)，但能否手術(shù)及保證手術(shù)效果的重要前提是化療有效。臨床上相當(dāng)患者因為化療耐藥或毒副作用大等問題，引起化療失敗，導(dǎo)致患者無法行保肢手術(shù)從而截肢，甚至無法手術(shù)而導(dǎo)致死亡[1]。 因此，提高化療療效對于骨肉瘤的治療來講具有重大意義。IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[2]，IFN-α 可直接抑制耐藥骨肉瘤細胞的生長[3]，然而其對骨肉瘤化療敏感性的影響目前尚不清楚。因此筆者聯(lián)合使用IFN-α 與依托泊苷（Etoposide）處理人骨肉瘤U2OS 和MG63 細胞，探討其對兩種細胞生長抑制和凋亡的影響，并研究其分子機制，以期為提高骨肉瘤對化療藥物敏感性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細胞U2OS（p53 基因野生型）和MG63（p53 基因突變型）購自中山大學(xué)病理教研室，培養(yǎng)液為DMEM（GIBCO 產(chǎn)品），其中含10%胎牛血清（GIBCO 產(chǎn)品）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱（Forma，美國）。

1.2 藥物處理

IFN-α 購自Peprotech 公司， 批號300-02A，Etoposide 購自Sigma 公司， 批號E1383， 稀釋分裝凍存-20℃， 使用時采用DMEM 培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，處理分為四組：對照組（加入與等量于其余組的DMEM 培養(yǎng)液）、IFN-α （加入含工作濃度藥物的DMEM 培養(yǎng)液使終濃度為5000 U/mL） 組，Etoposide（終濃 度 在U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG63 細 胞 為0.625 μg/mL）組和IFN-α＋Etoposide（終濃度同上）組。

1.3 流式細胞術(shù)檢測

細胞經(jīng)處理后， 消化離心， 收集細胞；PBS 洗兩次，離心；70%乙醇固定過夜；細胞經(jīng)10 μmol/L 的碘化丙啶（PI）染色5 min，4℃避光30 min；上FCM 流式細胞儀（BD，美國）用488 nm 激發(fā)光檢測細胞DNA含量，LYSIS 軟件分析凋亡率。

1.4 DNA Ladder 檢測

細胞經(jīng)各處理后，消化離心，收集細胞；PBS 洗兩次；加入0.8 mL 的DNAzol（Invitrogen 產(chǎn)品，批號：10503-027），室溫放置數(shù)分鐘；4℃離心15 min；將上清移入新EP 管， 加入0.4 mL 的無水乙醇；4℃離心10 min；棄上清，加入75%乙醇洗2 次，加入適量TE 溶解基因組DNA，在含有EB 的1.8%瓊脂糖凝膠電泳（水平電泳槽為北京六一廠產(chǎn)品），紫外線激發(fā)，凝膠成像分析儀（Bio-Rad，美國）采集DNA 梯形條帶。

1.5 Western blot

收集細胞，PBS 清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA 法），SDS-PAGE 電泳（垂直電泳儀為美國Bio-Rad 產(chǎn)品），然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜（電轉(zhuǎn)儀為美國Bio-Rad 產(chǎn)品），將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，4℃過夜； 鼠抗人p53、MDM2、Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體和兔抗人PARP 多克隆抗體均為SantaCruz公司產(chǎn)品，稀釋后室溫封膜3 h 或4℃過夜，二抗稀釋后室溫封膜1 h 或4℃過夜， 暗室ECL 化學(xué)發(fā)光，膠片顯影，定影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 14.0 軟件進行統(tǒng)計分析， 計數(shù)資料以率表示，組間比較采用q 檢驗。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞對Etoposide 引起凋亡的影響

U2OS 和MG63 細胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL）和etoposide（U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL、MG6 細 胞 為0.625 μg/mL）單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行流式細胞術(shù)檢測凋亡率,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，U20S 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 的細胞凋亡率分別為：（5.1±2.3）%、（5.7±2.7）%、（15.3±3.8）%和（45.5±5.2）%（圖1A），結(jié)果表明IFN-α 單獨并不誘導(dǎo)明顯的U2OS 細胞凋亡，卻明顯增強了Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細胞凋亡，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。然而同樣處理MG63 細胞后結(jié)果顯示，MG63 細胞在對照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 組的細胞凋亡率分別為：（2.2±0.8）%、（2.5±1.1）%、（23.8±4.6）%和（24.9±5.3）%（圖1B），表明IFN-α 不僅單獨不誘導(dǎo)明顯的MG63 細胞凋亡， 也無增強Etoposide 誘導(dǎo)的MG63 細胞凋亡的作用，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測α 干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63細胞凋亡的影響

2.2 IFN-α 在U2OS 和MG63 細胞中對“DNA 梯形條帶”的影響

U2OS 和MG63 細胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL）和etoposide （U2OS 細 胞 為2.5 μg/mL，MG6 細 胞 為0.625 μg/mL）單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行DNA Ladder 電泳。 DNA Ladder 是凋亡的特征性表現(xiàn)，結(jié)果顯示， 與其他各組相比，IFN-α/Etoposide 組的U20S 細胞出現(xiàn)明顯的梯形條帶（圖2A）；而在MG63 細胞，各組均未出現(xiàn)明顯梯形條帶（圖2B）。 表明IFN-α 可明顯增強Etoposide 誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞凋亡， 并且這種效應(yīng)僅出現(xiàn)在p53 功能正常的U2OS 細胞中，而在因突變導(dǎo)致p53 功能喪失的MG63 細胞中無此效應(yīng)，提示了p53 可能參與此效應(yīng)。

圖2 DNA 梯形條帶分析α 干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63 細胞凋亡的影響

2.3 IFN-α 在U2OS 細胞中對Etoposide 引起PARP活化的影響

U2OS 細胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL） 和etoposide（2.5 μg/mL）單獨或聯(lián)合處理72 h 后進行western blot檢測PARP 蛋白活化。 采用Western blot 法檢測凋亡關(guān)鍵酶PARP 的裂解，結(jié)果表明，在U2OS 細胞，對照組、IFN-α 組和Etoposide 組均未出現(xiàn)PARP 的活化，在聯(lián)合用藥組可見116 KD 的無活性PARP 前體明顯裂解為85 KD 的活化片段（圖3）。提示聯(lián)合用藥明顯增強PARP 活化，從而觸發(fā)U2OS 細胞凋亡。

圖3 α 干擾素在U2OS 細胞中增強依托泊苷誘導(dǎo)的PARP 裂解活化（Western blot 法）

2.4 IFN-α 對Etoposide 活化p53 凋亡通路的影響

為進一步驗證IFN-α 對Etoposide 的增敏作用與野生型p53 的功能有關(guān)，筆者進一步檢測了p53 凋亡通路相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2、Mdm2 等的表達。如圖4所示， 在U2OS 細胞中，IFN-α 單獨對p53 及其靶基因MDM2 的表達無明顯影響， 而Etoposide 可明顯增強二者的表達， 聯(lián)合用藥則進一步增高二者的表達。Bax 和Bcl-2 均是p53 的下游調(diào)控基因， 促凋亡的Bax 的表達被Etoposide 增高， 并被IFN-α+Etoposide進一步增強；與對照組相比，抗凋亡的Bcl-2 的表達雖然在Etoposide 組無變化，卻被聯(lián)合用藥明顯減弱。因此p53、Bax、MDM2 和Bcl-2 的表達變化與凋亡保持同步， 提示了在IFN-α 通過激活p53 凋亡通路增強Etoposide 誘導(dǎo)U2OS 細胞凋亡。 然而在MG63 細胞中，上述基因的蛋白表達均無明顯變化，與MG63細胞中的陰性結(jié)果相符合。

圖4 IFN-α 在U2OS、MG63 細胞中對Etoposide 誘導(dǎo)p53，Bax，Mdm2 和Bcl-2 表達的影響（Western blot 法）

3 討論

干擾素是一類多功能細胞因子， 具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[1]，包括Ⅰ型和Ⅱ型， 其中IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素， 可與細胞表面的IFN-α/β 受體結(jié)合， 從而引起JAK1 和TYK 的活化，活化的JAK1 和TYK 可分別使STAT1 發(fā)生和酪氨酸位點（Tyr701）和絲氨酸位點（Ser727）的磷酸化，磷酸化的STAT1 蛋白形成同源或異源二聚體， 進入細胞核與其靶基因啟動子上的干擾素刺激反應(yīng)元件或者γ 活化序列結(jié)合，進而調(diào)控下游基因表達[4]。 IFN-α 也是臨床治療腫瘤的第一種細胞因子， 已用于膀胱癌、腎癌、肝癌、白血病的臨床治療[5]。

以依托泊苷、阿霉素、順鉑等DNA 損傷性藥物為代表的傳統(tǒng)化療藥物已廣泛用于人類骨肉瘤的新輔助化療，并獲得一定療效，但因其無腫瘤靶向特異性，常常在殺滅腫瘤細胞的同時也破壞正常組織細胞，從而帶來嚴(yán)重的毒副作用，最終導(dǎo)致化療的失敗并影響骨肉瘤的最終療效[6-7]。 有研究表明IFN-α 本身即可抑制多藥耐藥的骨肉瘤細胞生長[3]，那么IFN-α 聯(lián)合化療藥物對骨肉瘤細胞的生長是否存在協(xié)同作用，筆者對此進行了一系列研究。

CAD（caspase activated DNAase）是細胞中一種能切割染色質(zhì)的核酸酶， 可被caspase-3 激活，CAD 可識別DNA 序列中的特定位點，將細胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷，從而形成180～200 bp或其整數(shù)倍大小的寡核苷酸片段， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會出現(xiàn)梯形電泳條帶，是凋亡的特征性表現(xiàn)，因而成為鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[8]。 筆者從流式細胞術(shù)和形態(tài)學(xué)兩方面證明IFN-α 對U2OS 細胞無明顯影響，卻明顯增強Etoposide 誘導(dǎo)凋亡， 提示二者聯(lián)用比化療藥物單用具有更好的抗癌作用。 并且，在U2OS 細胞中，聯(lián)合用藥可明顯增強PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]的活化。實際上，PARP 是反映凋亡的經(jīng)典指標(biāo)，受到促凋亡信號的刺激后，細胞內(nèi)蛋白酶Caspases 家族成員caspase 8、9 被激活， 繼而激活下游效應(yīng)性caspase 3，最終裂解其底物PARP 發(fā)生活化，最終導(dǎo)致細胞凋亡[9]。 上述變化在p53 基因突變而喪失功能的MG63 細胞中卻沒有發(fā)生，這提示此效應(yīng)可能與p53 有關(guān)。 p53 是一個經(jīng)典的抑癌基因，在超過50%的惡性腫瘤包括骨肉瘤中都存在缺失或突變， 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]， 作為凋亡調(diào)控的主要靶點， 激活的p53 可通過調(diào)節(jié)其下游基因如MDM2，Bax、Bcl-2 等的轉(zhuǎn)錄和表達，誘導(dǎo)細胞走向凋亡[10]。 目前，p53 已被認為是眾多化療藥物（包括Etoposide）抗癌作用的主要介導(dǎo)者[7]。 不僅如此，最近研究表明，p53 也參與了IFN-α 引發(fā)的信號通路[11]。 筆者發(fā)現(xiàn)，Etoposide 激活了p53 及其下游基因如MDM2、Bax 等的表達。 IFN-α 雖然單獨應(yīng)用對p53 通路無明顯影響， 卻明顯增強Etoposide 引起的p53、Bax 和MDM2的表達，同時減弱了Bcl-2 的表達，充分說明IFN-α通過激活p53 依賴性信號通路增強Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細胞凋亡。

MDM2 基因是調(diào)節(jié)p53 的一個重要因子， 它在細胞核中直接與p53 結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并通過胞核-胞漿穿梭將p53 轉(zhuǎn)運至胞漿并使其降解，從而降低p53 水平；另一方面，p53 的上調(diào)可激活MDM2轉(zhuǎn)錄表達，來反饋性抑制p53 蛋白的繼續(xù)增高。如此二者形成一個負反饋調(diào)節(jié)環(huán)， 使細胞內(nèi)MDM2/p53比率保持恒定[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥引起的p53上調(diào)伴隨著MDM2 水平的升高，表明p53 的上調(diào)反饋性地激活了MDM2 的表達，使其水平升高。Bax 和Bcl-2 基因同屬Bcl-2 家族， 均為p53 的靶基因，表達于線粒體，是調(diào)控細胞凋亡的重要基因[13]。二者功能相互拮抗，Bax 具有促進凋亡的作用，Bcl-2 則具有抗凋亡的作用， 二者的比例決定了細胞是否走向凋亡[14-16]。 而聯(lián)合用藥通過激活p53 上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2，使Bax/Bcl-2 比例增高，從而促使細胞發(fā)生凋亡。

因此，IFN-α 可通過誘導(dǎo)p53 依賴性凋亡來增強骨肉瘤U2OS 細胞對依托泊苷的敏感性，提示IFN-α與骨肉瘤傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可望成為提高骨肉瘤化療療效的新方向。

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