富含巖藻糖蘋果皮果膠的提取與理化性質

程 洋，張 英，段雙艷，黃琳娟，王仲孚

（西北大學生命科學學院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，陜西省生物技術重點實驗室，陜西 西安 710069）

富含巖藻糖蘋果皮果膠的提取與理化性質

程 洋，張 英，段雙艷，黃琳娟，王仲孚*

（西北大學生命科學學院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，陜西省生物技術重點實驗室，陜西 西安 710069）

以超聲輔助檸檬酸提取法從蘋果皮中提取蘋果果膠，并對所提取蘋果皮果膠進行理化性質測定和分析。在最佳提取條件下（pH 2.5檸檬酸，450 W超聲30 min），蘋果皮果膠得率為14.6%。理化性質分析表明：所得蘋果皮果膠的酯化度為69.9%、糖醛酸含量為58.5%、總糖含量為92.8%，分子質量大于400 kD。氣相色譜法分析表明：該方法提取的蘋果皮果膠由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸8種單糖組成，單糖組成的物質的量比為9.5：19.2：4.6：0.1：4.6：3.6：2.3：56.3，巖藻糖含量高達19.2%。而超聲法、鹽酸法提取的蘋果皮果膠中未檢測到巖藻糖。進一步研究表明：富含巖藻糖的蘋果皮果膠的提取與檸檬酸作萃取劑有一定關系。

蘋果皮果膠；提??；巖藻糖；理化性質

中國是一個蘋果種植大國，近幾年產(chǎn)量一直維持在3 000萬t以上，約占世界總產(chǎn)量的40%，同時又是濃縮蘋果汁的主要生產(chǎn)及出口國，蘋果皮渣是果汁、果醬、果脯等生產(chǎn)加工過程中主要的下腳料，約為總加工量的20%～25%[1]。目前，除少量蘋果皮渣被用于飼料及深加工外，絕大部分被遺棄，不僅造成資源的浪費，而且嚴重污染環(huán)境。果皮的主要成分是果膠，是一類以聚半乳糖醛酸為主、結構復雜的多糖聚合物。果膠的食物纖維是維持人體健康的重要物質，具有增強胃腸蠕動促進營養(yǎng)吸收的功能，對防治高血壓、腸癌、糖尿病很好的作用。在食品工業(yè)中果膠作為凝膠劑、穩(wěn)定劑、增稠劑已被廣泛應用[2]。果膠也被應用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，研究發(fā)現(xiàn)果膠能有效降低心臟病和膽結石發(fā)病率[2-3]。

目前，果膠的提取方法主要有水提、酸提及酶法等[1]。其中酸提法由于操作方便、提取效率較高、所用試劑和工具價格低廉，因而應用比較廣泛。酸提法是利用稀酸將果皮細胞中的非水溶性原果膠轉化成水溶性果膠，然后在果膠液中加入乙醇或多價金屬鹽類，使果膠以沉淀析出，常用的酸有鹽酸、硫酸、亞硫酸、草酸銨等，但是在提取過程中果膠支鏈容易遭到破壞，影響結構的完整度，并且提取周期長、效率低。此外，傳統(tǒng)酸法得到果膠的種類比較單一，很難全面系統(tǒng)評價其理化性質和生物活性，因而限制了果膠的開發(fā)利用。

Kumar等[4]研究表明，以pH 2.5的檸檬酸和鹽酸為萃取劑提取蘋果皮果膠時，發(fā)現(xiàn)用檸檬酸提取的蘋果皮果膠支鏈破壞小，更好的保持了果膠結構的完整性。但該方法仍無法克服酸提取法存在的提取液黏度大、生產(chǎn)周期長、效率低等缺陷。而超聲法可提高果膠的提取產(chǎn)率和效率[5-7]。Seshadri等[8]研究了超聲提取對果膠分散體流變力學和光學的影響，發(fā)現(xiàn)超聲可改變果膠凝膠流動性，凝膠強度和凝膠時間會隨著超聲時間的延長而降低，進而提高果膠的溶解度，同時降低了提取液的黏度。

基于此，本研究以檸檬酸萃取和超聲輔助提取法結合，從蘋果皮中提取富含巖藻糖的蘋果皮果膠，確定了最優(yōu)提取條件；系統(tǒng)地測定了該法所得蘋果皮果膠的總糖含量、酯化度、糖醛酸含量、單糖組成等理化性質，并與現(xiàn)有方法進行比較；同時對富含巖藻糖蘋果皮果膠的提取機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西禮泉紅富士蘋果購自陜西省李泉縣城果品批發(fā)市場；鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、硼氫化鈉（NaBH4）、正丙胺 上海國藥集團；葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、藍色葡聚糖（Mr=2 000 kD）、雞蛋白蛋白 美國Sigma公司；DEAE-52纖維素 上海恒信化學試劑有限公司；Dextran標準品（1、5、12、25、50、80 kD和150 kD） 德國Fluka公司。

1.2 儀器與設備

2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；2010型氣相色譜儀 日本島津公司；EQUINOX 55型傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果皮果膠的提取

水果刀取下新鮮的蘋果皮（約厚3 mm），用45 ℃去離子水清洗3 次，90 ℃水浴10～15 min，使果皮中的酶失活，過濾后用溫水漂洗除去溶出的糖類、色素及其他雜質[9]，真空干燥箱中70 ℃恒溫干燥，粉碎后制成干粉，保存于4 ℃冰箱備用。

取蘋果果皮干粉5 g，按表1所述方法進行浸提，對各組提取液分別進行濃縮、醇沉、除蛋白等處理[1]，得蘋果皮果膠。

表1 蘋果皮果膠的提取方法和條件Table1 Extraction methods and conditions for APs

1.3.2 糖含量、酯化度、糖醛酸含量和分子質量測定

分別采用苯酚-硫酸法[10]、滴定法[11]、間羥聯(lián)苯法[12]和高效凝膠滲透色譜法法[1]測定蘋果皮果膠的總糖含量、酯化度、糖醛酸含量及分子質量。

1.3.3 紅外分析

稱取2.0 mg樣品，在紅外干燥箱中去除水分后，采用KBr壓片法于4 000～400 cm-1范圍內(nèi)用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外光譜分析。

1.3.4 單糖組成分析

單糖標準（鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸）的衍生：按照同時測定糖醛酸和醛糖的衍生方法進行衍生[10]。

果膠樣品的衍生化反應：稱取樣品4 mg，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，121 ℃密閉水解2 h，將樣品中的多糖水解為單糖，然后按測定糖醛酸和醛糖的衍生方法進行衍生[10]。

1.3.5 氣相色譜條件

色譜柱：rtx-50柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 ?m)；載氣：氮氣；分流比19：1；進樣口溫度270℃；檢測器溫度280 ℃；升溫程序：180 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min上升至210 ℃，再以0.3 ℃/min上升至215 ℃，最后以6 ℃/min上升至240 ℃，保持30 min。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助檸檬酸法提取條件優(yōu)化

如圖1所示，在某一特定的超聲功率下，蘋果皮果膠的得率在一段時間內(nèi)隨著超聲時間的延長（10～40 min）而增加。在250 W條件下超聲40 min時，蘋果皮果膠達到最高得率13.2%；450 W條件下超聲30 min時，達到最高得率14.6%；700 W條件下超聲20 min時，達到最高得率13.6%。繼續(xù)延長超聲時間，果膠得率反而降低。結果表明超聲輔助檸檬酸法提取蘋果皮果膠的產(chǎn)率最大值為14.6%，與傳統(tǒng)法相比，產(chǎn)率提高，也節(jié)省了提取時間。當產(chǎn)率達到最大值時，繼續(xù)超聲會使產(chǎn)品得率降低，這可能是因為一方面超聲時間過長會導致提取液中雜質積累，增加了除蛋白過程中的損失；另一方面可能由于超聲時間過長溶液中的果膠會在熱降解和超聲的剪切效應下部分流失[13]?？紤]到蘋果皮果膠的提取時間和產(chǎn)率，以pH 2.5的檸檬酸為萃取劑，在450 W超聲30 min為最佳提取條件。

圖1 超聲輔助檸檬酸法中超聲時間與功率對果膠產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of extraction time and ultrasound power on the yield of APs

2.2 酯化度測定

酯化度是果膠凝膠特性的重要指標。本實驗采用滴定法對蘋果皮果膠進行酯化度分析。檸檬酸法、超聲提取法、超聲輔助檸檬酸提取法和傳統(tǒng)鹽酸提取法提取的蘋果皮果膠酯化度分別為67.4%、71.6%、69.9%和74.4%。超聲輔助檸檬酸提取法與檸檬酸、超聲和傳統(tǒng)鹽酸提取法相比，提取所得蘋果皮果膠的酯化度變化不大。

2.3 糖醛酸含量分析

蘋果皮果膠的糖醛酸含量測定用間羥聯(lián)苯法。以己糖醛酸標準品含量為橫坐標、以對應的標準己糖醛酸溶液有色衍生物的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線回歸方程為：Y=0.012 9X-0.008 1，相關系數(shù)R2=0.999 1。檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法和傳統(tǒng)鹽酸法提取所得蘋果皮果膠的糖醛酸含量分別為56.5%、62.0%、58.5%和76.6%。結果表明用檸檬酸法和超聲輔助檸檬酸法提取的蘋果皮果膠糖醛酸含量偏低，因而推測這2種方法提取的蘋果皮果膠具有更多的中性糖側鏈分支，側鏈分支降解少。

2.4 分子質量測定分析

采用高效凝膠滲透色譜法對果膠分子質量進行測定。結果表明，用檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法及傳統(tǒng)鹽酸法提取所得蘋果皮果膠的分子質量均大于400 kD。

2.5 糖含量測定

測定蘋果皮果膠的總糖含量采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖含量為橫坐標、以對應葡萄糖吸光度為縱坐標，得線性回歸方程為Y=1.863 3X＋0.002 2，R2=0.999 1。結果顯示，檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法與傳統(tǒng)鹽酸法提取的蘋果皮果膠總糖含量分別為92.1%、91.8%、92.8%和92.7%。

2.6 果膠紅外圖譜分析

圖2 不同提取方法所得果膠的紅外圖譜分析Fig.2 FTIR spectra of pectins extracted by different methods

如圖2所示，4種方法所得蘋果皮果膠都具有果膠的特征吸收峰，都在3 620～3 020 cm-1和3 000～2 800 cm-1處有吸收峰，分別為—OH的伸縮振動和糖類的—CH2或—CH3的C—H伸縮振動；1 620～1 550、1 440～1 395、1 400～1 300 cm-1處的吸收峰分別為C=O的非對稱伸縮振動、C—O伸縮振動、C=O對稱伸縮振動；1 320～1 210 cm-1處的吸收峰為—OH變角振動；1 151.64、1 025.04 cm-1左右都有吸收峰，為吡喃型糖的特征吸收峰，是其糖苷鍵的C—O—C的非對稱振動峰[14]。4種果膠在1 750～1 700 cm-1處有典型的糖醛酸的特征吸收峰。

2.7 蘋果皮果膠的單糖組成分析

表2 不同方法提取所得蘋果皮果膠的單糖組成及含量分析Table2 Monosaccharide components and their contents in pectins extracted by different methods

檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法和傳統(tǒng)鹽酸法提取所得蘋果皮果膠，在單糖組成方面具有較大差異（表2）。檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法和傳統(tǒng)鹽酸法提取的蘋果皮果膠中性糖相對含量分別為44.6%、37.8%、41.6%、23.9%，可見用檸檬酸法、超聲輔助檸檬酸法提取的蘋果皮果膠中性糖含量明顯高于超聲法及傳統(tǒng)鹽酸法。

表3 不同酸法提取的蘋果皮果膠單糖組成及含量分析Table3 Monosaccharide components and their contents in APs extracted by different acid methods

以Rha與GalA相對含量比表示果膠的分支程度，比值越高說明分支度更高[15]。結果表明，檸檬酸法、超聲輔助檸檬酸法提取的蘋果皮果膠中，Rha與GalA物質的量比分別為1：5和1：7；而超聲提取法與傳統(tǒng)提取法提取的蘋果皮果膠中Rha與GalA物質的量比值僅分別為1：16和1：70，因此用檸檬酸法和超聲輔助檸檬酸法提取蘋果皮果膠能獲得更多的支鏈，果膠局部降解較少。

此外，氣相色譜分析結果顯示，用檸檬酸法、超聲輔助檸檬酸法提取的蘋果皮果膠中Fuc含量分別高達18.9%和19.2%。據(jù)報道，一般酸法或超聲法提取的蘋果皮果膠中較少發(fā)現(xiàn)Fuc，或者其中的Fuc含量較低[5]。本研究結果表明，用檸檬酸作萃取劑可能是富含巖藻糖果膠得率高的一個主要原因。

圖3 不同提取方法所得果膠的單糖組成色譜圖Fig.3 GC Analysis of the monosaccharide compositions of pectins extracted by different methods

為了進一步確認是否以檸檬酸作為萃取劑可得到富含F(xiàn)uc的蘋果皮果膠，分別用pH 2.5的鹽酸、亞硫酸、蘋果酸、酒石酸為萃取劑提取蘋果皮果膠。采用氣相色譜法對各種方法所得蘋果皮果膠進行單糖組成分析。如表3所示，在鹽酸法、亞硫酸法、蘋果酸法、酒石酸法提取的蘋果皮果膠中，所得的單糖含量及種類具有一定的差異，但均未發(fā)現(xiàn)含有Fuc，從而證實了所得的富含F(xiàn)uc的蘋果皮果膠與檸檬酸作為萃取劑有必然關系。

Jean-Pierre等[15]用檸檬酸萃取茶樹葉果膠時，發(fā)現(xiàn)其中含有一定量Fuc，含量為1.4%。Kurita等[16]提取柑橘皮果膠時，發(fā)現(xiàn)用檸檬酸處理2 h后，再用鹽酸萃取劑提取柑橘皮果膠，得到的果膠聚合度高，但半乳糖醛酸聚糖結構被破壞，中性糖相對含量顯著增加，同時發(fā)現(xiàn)Fuc從微量增加到0.8%；還發(fā)現(xiàn)用檸檬酸處理的柑橘果膠與未處理過的相比，Ara含量降低了82%，Ara結構單元在酸溶液中發(fā)生了大量的降解[16-19]，導致檸檬酸提取的蘋果皮果膠中含有更多的鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅰ（RG-Ⅰ）和鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（RG-Ⅱ）側鏈（富含F(xiàn)uc）。本研究采用檸檬酸結合超聲法提取的蘋果皮果膠中，Ara相對含量僅為4.6%，進一步證實了用pH 2.5的檸檬酸提取蘋果皮果膠時，阿拉伯聚糖結構單元在檸檬酸溶液中發(fā)生了大量的降解[20]，獲得了更多的RG-Ⅰ和RG-Ⅱ側鏈，從而得到了富含F(xiàn)uc的蘋果皮果膠，這與Darvill等的研究一致[21]。

3 結 論

本研究以超聲輔助檸檬酸法提取得到了富含F(xiàn)uc的蘋果皮果膠，克服了傳統(tǒng)法耗時、果膠支鏈易破壞和結構單一等缺陷，在蘋果皮果膠的提取生產(chǎn)研究中有重要的方法參考意義。在450 W超聲30 min，蘋果皮果膠的產(chǎn)率最高達14.6%。氣相色譜分析表明，以檸檬酸法、超聲法、超聲輔助檸檬酸法和傳統(tǒng)鹽酸法提取所得的蘋果皮果膠中，Rha與GalA的物質的量比分別為1：5、1：16、1：7、1：70，結果顯示與超聲法和傳統(tǒng)鹽酸法相比，用檸檬酸法和超聲輔助檸檬酸法提取蘋果皮果膠含有更多的支鏈。

研究結果顯示，用超聲輔助檸檬酸法提取所得的蘋果皮果膠中Fuc含量高達19.2%，豐富了果膠的種類，有助于全面系統(tǒng)地來研究果皮或果渣中果膠的理化性質和生物活性。此外，研究結果證實了所得的富含F(xiàn)uc的蘋果皮果膠與采用檸檬酸作萃取劑有必然關系，可能是果膠中阿拉伯聚糖結構單元在檸檬酸溶液中發(fā)生了降解，得到了更多的富含F(xiàn)uc RG-Ⅰ和RG-Ⅱ側鏈的果膠。

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Extraction and Physico-chemical Properties of Fucose-Rich Pectins from Apple Peel

CHENG Yang, ZHANG Ying, DUAN Shuang-yan, HUANG Lin-juan, WANG Zhong-fu*
(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China)

In this study, apple pectins (APs) were extracted from apple peel by ultrasound-assisted extraction with citric acid, and investigated for physico-chemical properties. Under the optimized conditions of pH 2.5 citric acid solution as the extraction solvent, 450 W ultrasound power and 30 min radiation time, the yield of APs was 14.6%. The extracted APs were characterized by a degree of esterification of 69.9% and a molecular weight larger than 400 kD, and contained 92.8% total sugar, 58.5% aldonic acid. GC data indicated that the APs consisted of eight monosaccharides including Rha, Fuc, Ara, Xyl, Glc, Gal, GlcA and GalA, with a relative molar ratio of 9.5:19.2:4.7:0.1:4.6:3.6:2.3:56.3 and a significantly high percentage of Fuc, reaching 19.2%. Further results revealed that the extraction of Fuc-rich APs was likely associated with the method using citric acid as the extraction solvent.

apple pectin; extraction; fucose; physico-chemical properties; citric acid

O629.12

A

1002-6630（2014）10-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201410002

2013-07-16

國家自然科學基金面上項目（31071506）；陜西省教育廳自然科學基金項目（2013JK0714）

程洋（1987—），男，碩士研究生，研究方向為植物多糖的分離提取與活性測定。E-mail：chengyangn@163.com

*通信作者：王仲孚（1971—），男，教授，博士，研究方向為糖生物學與糖工程學。E-mail：wangzhf@nwu.edu.cn