臺(tái)蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

王朝雯，王云艷，肖春宏，孫小琴，楊柏云

(1.臨滄師范高等?？茖W(xué)校數(shù)理系，云南臨滄677000;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031)

臺(tái)蘭(Cymbidium floribundum var.pumilum)又名蜜蜂蘭、蜂子蘭、金棱邊、蒲蘭等，為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)多年半地生性蘭科植物。蘭花的種質(zhì)資源是選種育種的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源一旦滅絕，無(wú)法再造，從這一意義上來(lái)說(shuō)，野生蘭花若再不加以保護(hù)，將會(huì)對(duì)世界蘭花的育種、研究造成不可彌補(bǔ)的損失，并將會(huì)直接威脅到我國(guó)蘭花經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展。目前，關(guān)于蘭科植物的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、分類學(xué)、生理學(xué)、孢粉學(xué)、區(qū)系地理學(xué)和繁殖生物學(xué)等方面［1－2］，而關(guān)于居群遺傳學(xué)的研究則很少。

近年來(lái)，應(yīng)用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行遺傳多樣性研究已有較多報(bào)道［3－5］，而采用ISSR技術(shù)對(duì)野生臺(tái)蘭的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究鮮有報(bào)道。筆者以采自江西省贛州市齊云山的臺(tái)蘭作為試驗(yàn)材料，對(duì)臺(tái)蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以建立比較完善的反應(yīng)條件，以期為建立為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行臺(tái)蘭遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)樣品采自江西省贛州市齊云山的一個(gè)自然居群，每個(gè)居群采集15～20個(gè)樣本。記錄采集樣品的經(jīng)緯度、海拔和生境，同時(shí)對(duì)每個(gè)居群采集憑證標(biāo)本供研究用。采集完成后用硅膠干燥法進(jìn)行處理、保存，備用。

1.2 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取臺(tái)蘭基因組DNA，步驟如下:①取0.05 g硅膠干燥的臺(tái)蘭葉片材料，置于1.5 ml離心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75ml 65 ℃預(yù)熱的2×CTAB 抽提緩沖液(pH8.0)，20μlβ-硫基乙醇，輕輕搖動(dòng)使溶液分散均勻，65℃水浴1 h，水浴過(guò)程每隔10 min輕輕搖動(dòng)。②冷卻至室溫，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混合均勻，12 000 r/min離心10 min。③吸取上層液相轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管，加等體積氯仿異戊醇，搖勻。④12 000 r/min離心10min。取上層液相，加1/10體積3mol/L的冰醋酸鈉，2倍體積－20℃的無(wú)水乙醇，－20℃保存20 min。⑤勾出DNA。⑥加70%乙醇洗滌2次，用無(wú)水乙醇洗滌1次，風(fēng)干。⑦用40μl 0.1TE溶解 DNA，－20℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA樣品的檢測(cè) 用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量;用分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度，DNA純度以O(shè)D260/OD280的比值來(lái)估算，濃度估算法為:DNA濃度(ng/μl)=OD260×50×稀釋倍數(shù)。計(jì)算DNA獲得率(DNA量/所用葉片量×100%)為1.8%。

1.4 ISSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.4.1 ISSR-PCR 條件篩選。反應(yīng)體系為25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物濃度為 0.4 μmol/L，雙蒸水 15.78 μl。為確定PCR反應(yīng)中其他4項(xiàng)因素(DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs)的最佳水平，試驗(yàn)用引物對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的這4項(xiàng)影響因素逐個(gè)進(jìn)行5個(gè)水平的研究，各反應(yīng)參數(shù)變化量見表1。反應(yīng)總體積為25μl(含2.5μl10×buffer和15.78 μl ddH2O)。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系各成分優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.2 ISSR引物篩選。ISSR引物根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)公布的序列設(shè)計(jì)，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，編號(hào)為UBC 808～UBC ISSR22，共96條引物。每次試驗(yàn)選擇Tm值接近的12個(gè)引物，具體見表2。

表2 ISSR引物及其序列

1.4.3 PCR 擴(kuò)增步驟及參數(shù)。取1.5 ml已滅菌 eppendorf管，依擴(kuò)增的樣本數(shù)計(jì)算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs→Taq酶，混勻后分裝到各擴(kuò)增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入PCR擴(kuò)增儀樣本中，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢，將樣本取出，置于4℃ 冰箱保存，等待電泳。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán);72℃延伸7min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并回收純化目的條帶。

1.5 電泳與拍照 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus(上海生物工程公司產(chǎn)品SM0321)為分子量標(biāo)記，用含有0.1%EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳(0.6 g瓊脂糖，40ml1×TAE緩沖液)，電泳緩沖液為1×TAE電泳緩沖液100 V穩(wěn)壓100mA電泳45～60min，凝膠成像儀下成像拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Taq DNA聚合酶對(duì) ISSR-PCR反應(yīng)的影響 試驗(yàn)設(shè)計(jì)了 Taq DNA 聚合酶5 個(gè)濃度梯度為0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同時(shí)對(duì) 5 個(gè)引物 18291、18294、18295、18297 和18298進(jìn)行篩選。圖1表明，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.18和0.20 U 時(shí)，擴(kuò)增譜帶模糊不清;濃度為 0.20、0.25、0.28 U時(shí)，擴(kuò)增譜帶較弱，且數(shù)量相對(duì)較少;濃度為0.22 U時(shí)擴(kuò)增條帶較多且較亮，效果最好，故確定為最佳濃度。同時(shí)可以看出引物18257和18297的條帶較為清晰而且數(shù)量較多，篩選出效果較好的引物為18257和18297。

圖1 Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

2.2 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 圖2表明，當(dāng)濃度為0.3 mmol/L時(shí)，幾乎無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物;在0.4 mmol/L時(shí)，雖有擴(kuò)增產(chǎn)物，但譜帶較弱不易辨認(rèn);濃度為0.5～0.7 mmol/L時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰的譜帶，但在0.6～0.7 mmol/L，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定且有非特異性擴(kuò)增;在0.6 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶較弱或一些大的片段擴(kuò)增缺失?？紤]到結(jié)果的穩(wěn)定性和減少試驗(yàn)成本，選用0.5 mmol/L的dNTPs濃度，在此濃度下，擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)。同時(shí)對(duì)引物18262、18265、18266、18268和18269進(jìn)行篩選，得出18265和18269擴(kuò)增效果較好。

2.3 M g2+濃度對(duì) ISSR-PCR反應(yīng)的影響 圖3表明，Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系影響不是很明顯，除濃度為2.0 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶稍亮些以外，其他濃度電泳出的條帶數(shù)目及清晰度基本類似。由此可見，臺(tái)蘭基因組DNA的ISSR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)Mg2+濃度不敏感，Mg2+含量許可范圍較大，但考慮到結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，選用2.0mmol/L為最佳濃度，同時(shí)篩選出較好的引物為18264和18267。

圖3 Mg2+濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

2.4 模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響 圖4表明，模板DNA濃度對(duì)臺(tái)蘭ISSR-PCR擴(kuò)增效果有一定的影響。臺(tái)蘭ISSR反應(yīng)對(duì)模板DNA濃度不甚敏感，模板含量許可范圍較大。在25μl反應(yīng)體系中，除了濃度400 ng幾乎沒有擴(kuò)增條帶，濃度在40～200 ng均能獲得比較清晰的譜帶，但在100 ng時(shí)擴(kuò)增出的條帶最多且清晰，又考慮到結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，因此選用100 ng作為適宜的模板濃度。同時(shí)對(duì)引物18249、18270、18315、18320 和18333 進(jìn)行篩選，選出效果較好的引物為18249和18315。

圖2 dNTPs濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

2.5 臺(tái)蘭優(yōu)化體系的建立 通過(guò)對(duì)以上各種影響因素的分析優(yōu)化，建立了反應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好的臺(tái)蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系:在25 μl反應(yīng)體系中含 2.5 μl 10 ×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0mmol/LMgCl2，0.4 μmol/L 引物，0.22 U Taq DNA聚合酶，100 ng模板DNA，雙蒸水15.78μl。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s，50～60℃退火(退火溫度隨引物不同而定，根據(jù)各引物的Tm值略低1～2℃)30 s，72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min，4℃保存。

為了檢測(cè)優(yōu)化的效果，試驗(yàn)利用建立的優(yōu)化體系，選用UBC822引物，在復(fù)性溫度為50℃條件下，對(duì)12個(gè)篩選的引物進(jìn)行批量擴(kuò)增。圖5表明，優(yōu)化后的反應(yīng)體系是比較理想的。

3 結(jié)論與討論

3.1 ISSR反應(yīng)體系主要成分對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響 ISSR是基于PCR反應(yīng)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有DNA用量少、操作簡(jiǎn)單、快速靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)［6］，但I(xiàn)SSRPCR擴(kuò)增反應(yīng)容易受許多因素的影響，如:Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度、dNTPs用量、DNA模板的濃度和純度等，而且這些因素之間存在相互作用。因此，不同物種的最佳擴(kuò)增條件各有不同，為確保ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，獲得較高的ISSR-PCR擴(kuò)增譜帶，提高分析的準(zhǔn)確性，針對(duì)不同物種相應(yīng)的反應(yīng)體系中各種影響因子進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最適宜的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件非常重要。

圖4 模版DNA濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響

圖5 引物UBC822的擴(kuò)增結(jié)果

在ISSR-PCR反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶的用量直接決定著實(shí)驗(yàn)的成功與否，量多不僅增加試驗(yàn)成本而且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物;量少則會(huì)使酶過(guò)早地消耗完，產(chǎn)物合成效率低［7］。試驗(yàn)中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U時(shí)條帶數(shù)量少且比較暗，用量多于0.22 U時(shí)條帶雖然沒有減少，但是出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明0.22 U是臺(tái)蘭ISSR-PCR反應(yīng)的最佳條件。

dNTPs是ISSR-PCR反應(yīng)的原料，通常dNTPs濃度范圍為 0.02 ～0.20mmol/L［8］。dNTPs為 Taq DNA 聚合酶提供底物，使產(chǎn)物得以延伸。當(dāng)dNTPs濃度過(guò)高，則導(dǎo)致Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤摻入，會(huì)導(dǎo)致PCR錯(cuò)配，從而使擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，影響擴(kuò)增的準(zhǔn)確性;濃度過(guò)低，又會(huì)影響合成效率，甚至?xí)蜻^(guò)早的消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果［9］。試驗(yàn)中dNTPs濃度為0.3和0.4 mmol/L時(shí)，因濃度太低而擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)少，濃度為0.5、0.6 和0.7mmol/L 時(shí)都有較多擴(kuò)增產(chǎn)物，但后兩者非特異性擴(kuò)增相對(duì)較多，結(jié)果表明0.5 mmol/L為dNTPs最佳濃度。

Mg2+濃度是影響ISSR-PCR結(jié)果的一個(gè)重要因素，Mg2+濃度不僅影響Taq酶的活性［10］，還能與反應(yīng)液中的dNTPs、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的合效率、模板與產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成［11］。試驗(yàn)中Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)無(wú)明顯影響，所設(shè)置的幾個(gè)濃度都有較多擴(kuò)增產(chǎn)物，但濃度為2.0 mmol/L時(shí)條帶較亮，結(jié)果表明2.0mmol/L為Mg2+最佳濃度。

DNA模板濃度也是影響ISSR-PCR擴(kuò)增效果的因素之一，濃度過(guò)低，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物;濃度過(guò)高，又會(huì)相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。最佳的模板濃度范圍取決于研究的物種和模板純度，在DNA模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內(nèi)的最低濃度，使抑制Taq DNA聚合酶的影響降到最小。試驗(yàn)中隨著DNA模板濃度升高，擴(kuò)增產(chǎn)物也相應(yīng)增加，但同時(shí)非特異性產(chǎn)物也在增加，因此，考慮到穩(wěn)定性和節(jié)約成本，試驗(yàn)采用的最佳DNA模板濃度為100 ng/L。

3.2 擴(kuò)增程序?qū)SSR-PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響 PCR程序設(shè)計(jì)中，重要的是復(fù)性溫度的制定，引物的退火溫度也極大地影響著ISSR反應(yīng)的進(jìn)行，由于引物堿基序列長(zhǎng)短不同使得引物的退火溫度也不盡相同。即使同一引物，在不同的植物樣品中的退火溫度也不一樣。在同一PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，退火溫度不同，產(chǎn)生錯(cuò)配的程度也不同，通常較低的溫度在保證引物與模板結(jié)合穩(wěn)定性的同時(shí)，也會(huì)使引物與模板之間為完全配對(duì)的一些位點(diǎn)間得到擴(kuò)增，即產(chǎn)生一定的錯(cuò)誤擴(kuò)增［12］。因此，在允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可減少引物與模板之間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性［13］。通過(guò)試驗(yàn)表明復(fù)性溫度最好比引物TM值略低1～2℃，這個(gè)溫度復(fù)性效果比較好。

PCR循環(huán)數(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物量有明顯的影響，選擇適宜的循環(huán)次數(shù)將會(huì)獲得良好的擴(kuò)增圖譜。從理論上說(shuō)，循環(huán)次數(shù)少，產(chǎn)物量少;循環(huán)次數(shù)越多，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率越高。但實(shí)際上，次數(shù)太多，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)后，循環(huán)不會(huì)使產(chǎn)物明顯增加，反而引起非特異性擴(kuò)增［14］。

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