容量激活性氯離子通道在大鼠低氧性PASMCs 中的表達(dá)及與p38MAPK 通路的關(guān)系

黃林靜 黎關(guān)龍 鄭夢(mèng)曉 馬迎春 金可可 王萬(wàn)鐵

研究表明，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)上存在多種氯離子通道，但是其中含量最多的為容量激活性氯離子通道(volume activated chloride channels，CLC3)，并且CLC3在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖方面起到了非常重要的作用［1］。低氧可以引起大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上JNK、ERK1/2 和p38MAPK 這3 類酶的激活［2］。而目前關(guān)于氯離子通道功能及其表達(dá)上下游信號(hào)通路研究的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞培養(yǎng)方法觀察了容量激活性氯離子通道在大鼠低氧性PASMCs 中mRNA 和蛋白表達(dá)的變化，并探討其與p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)信號(hào)通路的關(guān)系。

材料與方法

1.材料:SPF 級(jí)健康雄性Sprague - Dawley(SD)大鼠10只，體質(zhì)量為200 ±50g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)2010 -0101 號(hào)。

2.試劑及儀器:SB203580 (美國(guó)Sigma 公司);茴香霉素(Anisomycin，美國(guó)Sigma 公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO 上海申工生物技術(shù)有限公司);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶/EDTA(美國(guó)Gibco 公司);SM -α -actin 鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(英國(guó)abcam 公司);HRP 標(biāo)記β-actin(上?？党枪?;CLC3 兔抗鼠多克隆抗體(美國(guó)Sigma 公司);RT - PCR 試劑盒、50bp DNA Marker(Fermentas life sciences 公司);BCA 蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce 公司);RT -PCR 引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);PVDF 膜(美國(guó)，Milipore 公司);彩色預(yù)染蛋白maker(MBI，F(xiàn)ermentas 公司)。低氧培養(yǎng)箱(Herareus，美國(guó));顯微外科用顯微鏡(Olympus，日本);生物倒置相差顯微鏡XDS-1B(重慶光學(xué)儀器設(shè)備廠);蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio -Rad 公司);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-3 型，北京六一儀器廠);EXL -808 酶標(biāo)儀(USA);恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國(guó));凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad 公司);722N 分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PCR 儀(Thermo Hybaid，美國(guó))。

3.方法:(1)PASMCs 的獲取和處理:①酶消化法提取PASMCs;②PASMCs 的傳代培養(yǎng);③PASMCs 的凍存和復(fù)蘇;④PASMCs 存活率的測(cè)定;⑤差異貼壁法純化細(xì)胞［3］。(2)PASMCs 的鑒定:倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片;激光共聚焦免疫熒光染色法分別檢測(cè)PI 標(biāo)記的細(xì)胞核及FITC標(biāo)記的平滑肌α-actin 抗體。(3)實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)所用為4 ～6 代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前要將所有細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24h，分為5 組:①常氧組(N):DMEM 5%CO2，21%O2，37℃48h;②低氧組(H):DMEM 5% CO2，2% O2，37℃，48h;③DMSO 對(duì)照組(D):0.05% DMSO，5% CO2，2% O2，37℃48h;④SB203580 干預(yù)組(SB):10μmol/L SB203580，5%CO2，1% O2，37℃48h;⑤Anisomycin 干預(yù)組(A):10μmol/L Anisomycin，5% CO2，2% O2，37℃48h。以上每組6 皿細(xì)胞。(4)PASMCs CLC3 的蛋白和mRNA 表達(dá)的檢測(cè):①蛋白免疫印跡法檢測(cè)PASMCs CLC3 的蛋白含量;②RT-PCR 法檢測(cè)PASMCs CLC3 的mRNA 表達(dá)［3］。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet't 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.原代培養(yǎng)大鼠PASMCs 的培養(yǎng)和鑒定:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)生長(zhǎng)特點(diǎn):原代的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，呈典型的“峰-谷”狀生長(zhǎng)(圖1)。(2)免疫細(xì)胞熒光法鑒定PASMCs:發(fā)綠色熒光呈細(xì)絲狀的為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的α-肌動(dòng)蛋白，紅色卵圓形的為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核(圖2)。(3)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果:消化傳代的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率為96.7%，凍存后復(fù)蘇的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率為83.3%。

圖1 大鼠原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(×100)

圖2 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞免疫熒光鑒定(×400)

2. 各組PASMCs 上CLC3 mRNA 表達(dá)的變化:(1)低氧對(duì)PASMCs 上CLC3 mRNA 表達(dá)的影響:H組CLC3 mRNA 表達(dá)量顯著增加，與N 組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.784 ±0.011 vs 1.114 ±0.009，P ＜0.01)(圖3、圖4)，即低氧能增加CLC3 mRNA 的表達(dá)。(2)低氧條件下SB203580 對(duì)PASMCs 上CLC3 mRNA表達(dá)的影響:與N 組相比，D 組、SB 組和A 組CLC3 mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)(P ＜0.01 和P ＜0.05)。與H 組相比，D 組CLC3 mRNA 的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.114 ±0.009 vs 1.119 ±0.003，P ＞0.05)。與D組相比，SB 組CLC3 mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)(1.119±0.003 vs 1.322 ±0.027，P ＜0.01)，A 組CLC3 mRNA 的 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào)(1. 119 ± 0. 003 vs 0. 846 ±0.047，P ＜0.01)(圖3、圖4)，即 低 氧 條 件 下SB203580 能增加CLC3 mRNA 的表達(dá)。

圖3 各組細(xì)胞CLC3 mRNA 的表達(dá)

圖4 各組細(xì)胞CLC3 mRNA 表達(dá)變化的比較(±s，n=6)

3.各組PASMCs 上CLC3 蛋白表達(dá)的變化:(1)低氧對(duì)PASMCs 上CLC3 蛋白表達(dá)的影響:與N 組相比，H 組CLC3 蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.392 ±0.004 vs 0.525 ±0.029，P ＜0.01)(圖5、圖6)，即低氧能增加CLC3 蛋白的表達(dá)。(2)低氧條件下SB203580 對(duì)PASMCs 上CLC3 蛋白表達(dá)的影響:與N 組相比，D 組和SB 組和A 組CLC3 蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P ＜0. 01)。與H 組相比，D 組CLC3 蛋白表達(dá)略微下調(diào)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.525±0.029 vs 0.522 ±0.017，P ＞0.05)。與D 組相比，SB 組CLC3 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(0.522 ±0.017 vs 0.593 ±0.030，P ＜0.01)，A 組CLC3 蛋白的表達(dá)下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.522 ±0.017 vs 0.487 ±0. 029，P ＞0. 05)(圖5、圖6)，即低氧條件下SB203580 能增加CLC3 蛋白的表達(dá)。

圖5 各組細(xì)胞CLC3 蛋白的表達(dá)

討 論

圖6 各組細(xì)胞CLC3 蛋白表達(dá)變化的比較(±s，n=6)

氯離子是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)外分布最廣泛的陰離子，細(xì)胞膜氯離子的靜息通透性相對(duì)較大，血管平滑肌細(xì)胞氯離子平衡電位(約-34mV)比靜息膜電位(約-55mV)高［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，加入氯離子通道阻滯劑能明顯減輕肺動(dòng)脈的持續(xù)收縮，故氯離子通道在肺動(dòng)脈血管收縮方面起到了非常重要的作用［5］。平滑肌細(xì)胞的增殖是構(gòu)成肺動(dòng)脈高壓及各種血管疾病的關(guān)鍵因素，Qian 等［6］研究證明，靜態(tài)壓力促進(jìn)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，是通過(guò)上調(diào)CLC3 來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Hisadome 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CLC3 阻斷劑可顯著抑制各類血管的生成，而且CLC3 還與各種生物體的跨膜氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)物質(zhì)分泌密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn):在低氧條件下，PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達(dá)量明顯高于常氧條件下的表達(dá)量(P ＜0. 01)，表明低氧可上調(diào)大鼠PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達(dá)，低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成可能與CLC3 有關(guān)。

p38MAPK 是MAPK 家族的一員，是生物體內(nèi)重要的信號(hào)系統(tǒng)之一。它是缺血、低氧、激素、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子等各種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等信息傳遞途徑的交匯點(diǎn)和共同通路［8］。對(duì)于p38MAPK 現(xiàn)在研究比較多的是其對(duì)細(xì)胞的凋亡作用［9］。梁瑛琦等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低氧狀態(tài)下肺小血管壁p38MAPK 蛋白和mRNA 的表達(dá)量顯著增高，可能參與了大鼠肺動(dòng)脈高壓形成的病理生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用p38MAPK 通路抑制劑SB203580 后，PASMCs 中CLC3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，明顯高于DMSO 對(duì)照組(P ＜0.01)。應(yīng)用p38MAPK 通路激活劑Anisomycin 后，PASMCs 中CLC3 mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)，明顯低于DMSO 對(duì)照組(P ＜0.01)，蛋白表達(dá)輕微下調(diào)(P ＞0.05)。以上結(jié)果提示，SB203580 可上調(diào)PASMCs 上CLC3 mRNA 和蛋白的表達(dá)，Anisomycin 能下調(diào)PASMCs 中CLC3 mRNA 和蛋白的表達(dá)。由此推測(cè)p38MAPK 可能是CLC3 的上游分子并且可調(diào)控其表達(dá)水平。

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