中藥對惡性黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)外作用的研究進展

張石琳 鄒征云

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)簡稱惡黑，是一種惡性程度極高的腫瘤，是由黑色素細(xì)胞異常增生產(chǎn)生的，該細(xì)胞能產(chǎn)生黑色素，色素合成和酪氨酸代謝異?？芍聬汉诘男纬?，故其大多原發(fā)于皮膚，也可起源于眼、鼻腔等其他器官。惡黑浸潤和遷移能力強，擴散迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位多見于肺、腦［1］。近幾年其發(fā)病率和病死率都急劇上升，并呈年輕化趨勢，患者可在診斷數(shù)月內(nèi)死亡［2］。惡黑的預(yù)后受年齡、性別、發(fā)生部位、腫瘤Breslow 厚度及Clark 浸潤深度等因素影響。手術(shù)是本病早期的重要治療手段，一旦確診應(yīng)盡快手術(shù)切除，但易復(fù)發(fā)。后期主要化學(xué)治療，多藥聯(lián)合化療療效稍高于單藥化療，放射治療在手術(shù)切除不徹底、拒絕手術(shù)及不能手術(shù)者中有一定的療效，此外還有的治療手段包括免疫治療、基因治療、生物化療，均是目前臨床應(yīng)用較常見的手段，但療效不太理想。細(xì)胞間縫隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)是細(xì)胞間傳遞、交換物質(zhì)的重要的直接信息通道，是細(xì)胞間通訊的主要形式，腫瘤組織細(xì)胞間正因為該縫隙連接(GJ)數(shù)量減少，物質(zhì)交流通道的缺乏，導(dǎo)致化療藥物難以擴散到腫瘤組織而達(dá)到預(yù)期的有效濃度，抗腫瘤作用因此被削弱［3］。

一、惡性黑色素瘤中醫(yī)概況

中醫(yī)并無“惡性黑色素瘤”病名，屬黑療、惡瘡、失榮等范疇。先天不足，衛(wèi)外失固，臟腑虛損，毒邪乘虛而入，與血氣相博，邪留肌膚，致黑療、惡瘡。對于該病的中醫(yī)治療，強調(diào)辨證論治，扶正祛邪為宗旨，貫穿腫瘤發(fā)生、發(fā)展全過程。故郁仁存教授［4］在腫瘤治療中提出了“內(nèi)虛學(xué)說”“平衡學(xué)說”，以五臟辨證為主，尤重視肺脾腎三臟，整個療程分3 個時期，即化療前，補益脾腎、祛邪解毒為主，以增強抗腫瘤作用;化療時，和胃降逆、醒脾調(diào)中為主，以減輕化療毒不良反應(yīng);化療后，補益氣血、溫腎化瘀為主，并加用現(xiàn)代藥理研究證實確有抗腫瘤作用的中草藥，輔助協(xié)助抗腫瘤。中醫(yī)治療是我國的特色治療方法，中藥乃我國的特色資源寶庫，其種類繁多，在抗腫瘤治療方面具有其獨特的優(yōu)勢，從中藥中尋找具有抗腫瘤作用的藥物具有廣闊的前景。

二、中藥對惡性黑色素瘤的體內(nèi)外作用機制

1.抑制惡黑細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡:中藥姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種酚類色素，是姜黃的主要有效成分，其抗腫瘤作用研究較多。姜黃素以12.5、25.0、50.0、100.0μg/ml 4 個濃度梯度作用于黑色素瘤B16 - F10 細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72h，可顯著抑制細(xì)胞的增殖，促進其凋亡，并呈時間和劑量的依賴性［5］。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制小鼠B16 黑色素瘤細(xì)胞及A375 人惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖，與抑制p-Akt 蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞線粒體膜電位及激活caspase-3 有密切關(guān)系［6］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的兩種方式之一，其發(fā)生與基因調(diào)節(jié)有關(guān)，也被稱為程序性細(xì)胞死亡，關(guān)系到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和消退。邱實等［7］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素作用于A375 人惡黑細(xì)胞12h 即可觀察到細(xì)胞凋亡，在一定劑量范圍內(nèi)呈時間-劑量依賴性，同時發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中c -myc 基因表達(dá)水平降低，caspase -3的表達(dá)顯著升高，說明c -myc 表達(dá)的減少和caspase-3 表達(dá)的增加可能與姜黃素誘導(dǎo)A375 細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。陸雪芬［8］采用系統(tǒng)溶劑萃取法提取中藥白及各部位成分，發(fā)現(xiàn)白及的氯仿層和乙酸乙酯層均可誘導(dǎo)B16 小鼠惡黑細(xì)胞凋亡，氯仿層效果更明顯，可能為抑制細(xì)胞增殖的作用機制之一。

2.抑制惡黑細(xì)胞黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移:惡性腫瘤最主要的特點是具有局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，也是致死的主要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲是癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞及基質(zhì)相互作用的結(jié)果，黏附性是腫瘤細(xì)胞重要的功能之一，為腫瘤的生長提供了一個舒適的微環(huán)境，所以尋找破壞該黏附作用的藥物也是抗腫瘤的一大突破。白藜蘆醇是近年來研究較多的一味抗腫瘤中藥單體，通過實驗，采用細(xì)胞染色、慢速聚集法，發(fā)現(xiàn)其對B16BL6、A375、M14、MV13 惡黑細(xì)胞與基質(zhì)黏附均有抑制作用(P ＜0.05)，同時抑制了細(xì)胞聚集，為其抗腫瘤作用提供了依據(jù)［9，10］。袁華兵等［11］利用Transwell 小室研究開口箭皂苷，體外發(fā)現(xiàn)其對B16 -BL6 黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有抑制作用，體內(nèi)試驗通過對小鼠右后爪種植惡黑細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤向肺、脾、胸腺轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移較多，用開口箭皂苷藥物組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少。研究發(fā)現(xiàn)女貞子多糖抑制了黑色素瘤細(xì)胞的黏附能力，可能與抑制黑色素瘤黏附分子E -cadherin 的表達(dá)有關(guān)，打破了腫瘤細(xì)胞之間的黏附能力，破壞了腫瘤細(xì)胞的整體性，故發(fā)揮了其抗腫瘤的作用［12］。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種特異性的內(nèi)切酶，在惡性腫瘤細(xì)胞中普遍存在，參與腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移，降低其表達(dá)水平可能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡［13］。郭勇等［14］通過體外培養(yǎng)人惡性黑色素瘤A375 細(xì)胞，不同濃度苦參堿對其作用，發(fā)現(xiàn)HPA mRNA 的表達(dá)、細(xì)胞黏附能力和侵襲能力均明顯抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且這種抑制作用隨苦參堿濃度的增加而增強，提示苦參堿可能通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞HPA表達(dá)水平而抑制細(xì)胞浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。這也為抗腫瘤提供了一個新的依據(jù)。

3.誘導(dǎo)細(xì)胞分化:惡性腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞分化異常的結(jié)果，這一過程是可逆的。誘導(dǎo)分化是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下使惡性腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，向正?；蚪咏＜?xì)胞分化的現(xiàn)象。所以尋找分化誘導(dǎo)劑是非常有意義的。有對熊果酸(ursolic acid，UA)的研究發(fā)現(xiàn)其對B16 鼠惡黑細(xì)胞有較強的分化誘導(dǎo)作用，體外實驗中，實驗組經(jīng)UA 作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞核變小、規(guī)則，核質(zhì)比減少，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器變豐富，說明細(xì)胞在正?；?。體內(nèi)實驗中，B16 細(xì)胞體內(nèi)成瘤的能力顯著下降。結(jié)果說明UA 能明顯抑制B16 細(xì)胞增殖并呈時間和劑量依賴性，且形態(tài)向正常上皮細(xì)胞變化，惡性程度降低。趙連梅等［15］通過體外實驗，利用木鱉子醇提物(ethanol extract of cochinchina momordica seed，CMSEE)對小鼠黑素瘤B16 細(xì)胞作用，由原來的菱形或多邊形，經(jīng)藥物處理后成梭形，并出現(xiàn)樹突狀結(jié)構(gòu)，成典型的細(xì)胞分化狀態(tài)，并且這種誘導(dǎo)分化作用在低劑量時明顯，高劑量濃度的藥物作用后表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。說明CMSEE 誘導(dǎo)了黑素瘤細(xì)胞分化，可能為其抗腫瘤機制之一。

4.抑制腫瘤血管生成:惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移必須依靠新生血管提供足夠的營養(yǎng)才能實現(xiàn)。腫瘤屬于中醫(yī)積、癌等范疇，腫瘤患者的血液常處于一種高凝狀態(tài)，所謂血瘀則血行不暢，腫瘤的無限生長浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于血液的滋潤，豐富的血管網(wǎng)便是通道。腫瘤新生血管形成是血管中的內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞分泌的多種正負(fù)調(diào)節(jié)生長因子的共同調(diào)控作用下，增生、延伸而生成新的血管的過程，這些生長因子最重要的是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。其誘導(dǎo)血管生成作用最強、特異性最高。也有與促血管生成素- 2(angiopoietin -2，Ang-2)相關(guān)的［16］。腫瘤新生血管為腫瘤細(xì)胞向繼發(fā)部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了一條便捷的通道，增加了腫瘤細(xì)胞進入微循環(huán)的機會。因此，抑制和破壞腫瘤新生血管，阻斷腫瘤血供，使腫瘤細(xì)胞壞死及阻斷轉(zhuǎn)移，已成為腫瘤治療中一個有效的新策略。有研究者從120多種中草藥中篩選出兩種抗黑色素瘤效果比較好的中草藥石蒜和黃連，實驗對這兩者的單體成分鹽酸石蒜堿(LH)和鹽酸藥根堿(JH)進行抗黑色素瘤血管形成作用研究，發(fā)現(xiàn)兩者對人高轉(zhuǎn)移黑色素瘤C8161細(xì)胞主導(dǎo)的新生血管形成具有很好的抑制作用，其機制可能與下調(diào)血管形成的關(guān)鍵基因VE -cadherin 在C8161 細(xì)胞的表達(dá)，及抑制VE-cadherin 啟動子的活性有關(guān)。人參皂苷Rg3 可明顯抑制B16 黑色素瘤細(xì)胞的血管生成，可能通過下調(diào)VEGF 表達(dá)有關(guān)，實現(xiàn)抑制腫瘤新生血管形成的作用，進而抑制B16 黑色素瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［17］。

5.增強免疫:機體的免疫監(jiān)視體系在防止腫瘤發(fā)生上起重要作用，腫瘤的發(fā)生是免疫監(jiān)視功能喪失的結(jié)果。腫瘤可通過多種途徑逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。機體免疫力低下時對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能減弱，免疫功能低下的腫瘤患者預(yù)后也差。因此，阻斷腫瘤的免疫逃逸，對腫瘤的治療尤為重要，其中中藥多糖的發(fā)現(xiàn)無疑為這一領(lǐng)域提供了可靠的依據(jù)。Lin 等［18］通過近5 年來對多糖的研究發(fā)現(xiàn)，有些多糖對腫瘤細(xì)胞無直接抑制作用，而是通過增強機體的免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤作用，多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是目前公認(rèn)的抗腫瘤作用的主要機制之一。有研究者在體外實驗中，利用高轉(zhuǎn)移性的小鼠黑色素瘤B16F10 細(xì)胞培養(yǎng)上清作用于同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對同基因小鼠淋巴細(xì)胞有明顯抑制作用，實驗進一步用不同濃度的靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaccharides，Gl - PS)對共培養(yǎng)系統(tǒng)作用，實驗結(jié)果提示靈芝多糖可在不同程度上拮抗腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對淋巴細(xì)胞的抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。

6.抑制酪氨酸酶活性和黑色素合成:酪氨酸酶(tyrosinase)又稱為多酚氧化酶(polyphenol oxidase)，是黑色素生物合成的主要限速酶，其活性的大小直接決定黑色素的合成，它不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素細(xì)胞成熟的特征性標(biāo)志。抑制酪氨酸酶的活性可阻止黑色素的合成。該酶催化L -酪氨酸羥基化成L-多巴，再氧化形成多巴醌，再經(jīng)過一系列的氧化作用最后形成黑色素。紅景天、三葉青提取物等，在一定濃度范圍內(nèi)對惡黑細(xì)胞增殖有抑制作用，同時酪氨酸酶活性降低，黑色素生成減少，這可能是抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的機制之一［19，20］。研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)蟲斑鳩菊提取物質(zhì)量濃度＜10mg/L 范圍內(nèi)，對酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趨勢，并隨濃度增加可抑制人惡性黑色素瘤A375 細(xì)胞的增殖，＞20mg/L 時，顯示一定的細(xì)胞毒性作用。杏仁油對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 酪氨酸酶活性和黑色素生成有較強的劑量相關(guān)性抑制作用，這也為杏仁油在治療色素沉著性皮膚病的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

7.下調(diào)抗凋亡基因、促進凋亡蛋白表達(dá):中藥藤黃一直以來是人們研究的熱點，有效成分藤黃酸作為抗腫瘤一類新藥在2004 年確定為國家“863”計劃第3 批新立項項目。藤黃酸對A375 細(xì)胞的生長抑制作用具有明顯的時間-劑量依賴性，同時下調(diào)Bcl -2蛋白表達(dá)，Bax 表達(dá)增高，兩者比率Bcl -2/Bax 下降則抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡。Bcl -2 蛋白為抗凋亡蛋白，Bax 蛋白為凋亡蛋白，Bcl -2 蛋白具有抑制Bax 的功能。Bcl -2/Bax 比例升高，則抑制細(xì)胞凋亡，反之，則促進細(xì)胞凋亡。這也為抗腫瘤機制提供了一個新的研發(fā)點。

惡性黑色素瘤在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢，應(yīng)引起足夠的重視。在臨床上，對惡性黑色素瘤的診斷、治療理應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，以減少腫瘤轉(zhuǎn)移的機會，在運用傳統(tǒng)的治療方案基礎(chǔ)上，開發(fā)研究新型藥物顯得更為重要，中藥作為我國特色的資源產(chǎn)物，對惡黑細(xì)胞有一定的抑制作用，將其開發(fā)應(yīng)用于臨床具有重要的意義。

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