使用鏈脲佐菌素造模對1 型糖尿病大鼠調(diào)節(jié)性T 細胞的影響

高永亮 盧覓佳 楊紅忠 黃敏聰 宣堯仙

1 型糖尿病被認(rèn)為是一種由調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Tregs)介導(dǎo)并對胰島β 細胞造成不可逆轉(zhuǎn)破壞的代謝性疾?。?］。對于自發(fā)性1 型糖尿病動物模型和人的研究表明Tregs 在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中很重要的作用［2］。1995 年Sakaguchi 等［3］報道CD4+CD25+細胞減少會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，引起了人們對于該類型細胞功能的重視。Tregs主要包括兩類:natural regulatory T cells (nTregs)和inducible regulatory T cells (iTregs)，這兩類細胞分別產(chǎn)生于胸腺和脾臟，它們共同發(fā)揮作用保證了機體的免疫穩(wěn)態(tài)，免疫穩(wěn)態(tài)被打破即Tregs 數(shù)量或者功能失衡時會導(dǎo)致自身免疫性疾病的出現(xiàn)，如自發(fā)性1 型糖尿病發(fā)生和Tregs 具有相關(guān)性［4］。使用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)造模的實驗性1 型糖尿病動物模型能夠出現(xiàn)1 型糖尿病患者的大部分典型癥狀，廣泛應(yīng)用于糖尿病研究之中［5］。但使用STZ 造模1 型糖尿病大鼠致病機制Tregs 數(shù)量和功能的關(guān)系并未被完全揭示。本實驗在自發(fā)性1 型糖尿病模型與Tregs關(guān)系研究的基礎(chǔ)上，對實驗性1 型糖尿病模型大鼠Tregs 數(shù)量和功能的變化進行了研究，以探討實驗性1 型糖尿病模型致病機制與Tregs 數(shù)量和功能的關(guān)系。

材料與方法

1.試劑和儀器:鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自Sigma公司;氯化氨溶液、檸檬酸和檸檬酸三鈉購自華東醫(yī)藥公司;FACS 溶血素、1640 培養(yǎng)液、HANKS 緩沖液購自聯(lián)科生物有限公司;CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;pH 計購自梅特勒-托利多公司;羅氏卓越型血糖儀和血糖試紙購自Roche Diagnostics GmbH 公司;流式細胞儀、破膜試劑盒(transcription factor suit)、Anti-rat Foxp3+(PE)、Anti-ratCD4+(APC)、Anti-rat CD25+(PE)購自BD 公司;酶標(biāo)儀購自BioTek 公司;大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞提取試劑盒、MagCellect 磁性分離儀購自R＆D 公司。

2.實驗動物:試驗用無特定病原體(specific pathogen free)，SPF 級SD 大鼠30 只，雌雄各半，6 ～8 周齡，體重200 ～250g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。1 型糖尿病模型大鼠采用一次性大劑量注射60mg/ml STZ 緩沖液的方法造模。分別選取造模成功大鼠12 只和健康大鼠12 只。分組為模型組12 只、健康對照組12 只(各組均雌雄各半)。

3.流式細胞儀檢測胸腺、脾臟和外周血Tregs 數(shù)量:(1)大鼠胸腺、脾臟和外周血細胞懸液制備:將大鼠麻醉后腹主動脈采血，采血后處死分別取部分胸腺和脾臟，分別放入無菌培養(yǎng)皿中，加入10ml 平衡鹽溶液(HANKS)緩沖液;將取出的胸腺和脾臟研磨，過70 目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)至15ml 的離心管中;1500r/min 離心5min，去上清后加入5ml 氯化氨溶液，混勻后靜置10min;加入10ml 的PBS 緩沖液，1500r/min 離心8min;去上清，加15ml HANKS 緩沖液離心洗滌1 次，棄上清，PBS 緩沖液懸浮。(2)流式細胞儀檢測:待測懸液加入胞外抗體Anti-rat CD25+(PE)，2 ～8℃孵育30min。加入2ml Stain buffer，1500r/min 離心5min，棄上清;加入1ml Fix/Perm Buffer，吹散細胞，2 ～8℃孵育40 ～50min。加1ml Perm/Wash Buffer，2 ～8℃下350 ×g 離心6min，棄上清。加2ml Perm/Wash Buffer，吹散細胞，2 ～8℃下350 ×g 離心6min，棄上清。加80 ～100μl Perm/Wash Buffer，吹散細胞，加胞內(nèi)抗體Anti - rat Foxp3+(PE)，渦旋或振搖10s，2 ～8℃避光孵育40 ～50min。簡短振搖，加2ml Perm/Wash Buffer，350 ×g 離心6min，棄上清。加2ml Perm/Wash Buffer，350 × g 離心6min，棄上清。加350μl PBS 緩沖液懸浮細胞，使用流式細胞儀進行檢測。

4.免疫磁珠兩步法分選CD4+CD25+細胞及免疫抑制功能檢測:(1)大鼠脾臟細胞懸液制備:將大鼠麻醉處死，無菌環(huán)境下使用高溫消毒器具取部分脾臟，放入無菌培養(yǎng)皿中，加入10ml HANKS 緩沖液;將取出的脾臟研磨，過70 目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)至15ml 的離心管中;1500r/min 離心5min，去上清后加入5ml氯化氨溶液，混勻后靜置10min;加入10ml 的PBS 緩沖液，1500r/min 離心8min;去上清，加15ml HANKS 緩沖液離心洗滌1 次，棄上清，用1 ×MagCellect Buffer 懸浮，調(diào)整細胞濃度至1 ×108/ml。(2)免疫磁珠兩步法分選CD4+CD25+細胞:待分選懸液依次進行磁性分選。首先陰性選擇CD4+T 細胞，將2 ×108個細胞(2ml )轉(zhuǎn)移到5ml 試管中，分別加入200μl MagCellect CD4+T 細胞抗體和250μl MagCellect 抗鼠IgG 磁珠，依次輕輕混勻，分別在2 ～8℃孵育15min;加入550μl Buffer 輕輕混勻，調(diào)整懸液體積至3ml，將試管放于磁體中靜置10min;當(dāng)試管在磁體中時用無菌移液管將上清液吸出至于一新的5ml 試管中，放于磁體中靜置10min;取出上清至15m1離心管中，并計數(shù)。然后陽性選擇CD4+CD25+T 細胞，加入Buffer 至15ml，1100r/min 離心8min;去上清，加100μl Buffer混懸細胞，轉(zhuǎn)移到5ml 試管中;每1 ×107個細胞分別加10μl生物素標(biāo)記的抗鼠CD25 抗體和10μl MagCellect 抗生物素磁珠，依次在2 ～8℃冰箱中孵育15min;加Buffer 定容至1ml，輕輕混勻，使溶液處于懸浮狀態(tài)，將試管放于磁體中靜置6min，當(dāng)試管在磁體中時，用消毒的移液管吸出上清液并去除;從磁體中取出試管，加1ml Buffer 混懸細胞，重復(fù)后從磁體中取出試管，加1ml Buffer 混懸細胞，此為富含CD4+CD25+T 細胞的細胞懸液，進行細胞計數(shù)。(3)CD4+CD25+細胞免疫抑制功能檢測(CCK -8):CD4+CD25+T 細胞和CD4-T 細胞使用30μg/ml 絲裂霉素C 處理，每個待測樣品分為兩組，每組依照如表1 分別依次加入所示溶液。

表1 CCK-8 試驗各組加樣流程表

5.統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t 檢驗進行數(shù)據(jù)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.流式細胞儀檢測胸腺、脾臟和外周血Tregs 數(shù)量變化:模型組和健康對照組大鼠胸腺、脾臟、外周血中CD25+Foxp3+在CD4+中的比例情況(CD25+Foxp3+/CD4+)，未見統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05，表2 ～表4，圖1)。

表2 大鼠胸腺CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表2 大鼠胸腺CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組1.647 ±0.759 1.654 ±0.209健康對照組1.515 ±0.267 1.685 ±0.388

表3 大鼠脾臟CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表3 大鼠脾臟CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組2.367 ±1.390 3.345 ±1.15健康對照組2.533 ±1.514 3.430 ±1.18

表4 大鼠外周血CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

表4 大鼠外周血CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例(%，±s)

組別 雄鼠 雌鼠模型組4.548 ±1.946 6.590 ±2.327健康對照組5.563 ±1.175 5.851 ±2.282

圖1 模型組大鼠外周血(A)、脾臟(B)和胸腺(C)及健康對照組大鼠外周血(D)、脾臟(E)和胸腺(F)CD25 +Foxp3 + /CD4 +比例圖示

2.免疫磁珠分選CD4+CD25+細胞及免疫抑制功能檢測:模型組和健康對照組脾臟CD4+CD25+細胞分離提取以后通過CCK -8 細胞增殖實驗CD4+CD25-細胞增殖率對比來判斷CD4+CD25+細胞的免疫抑制功能，模型組CCK-8 細胞增殖實驗中選取的自體和異體CD4+CD25-細胞在增殖后與健康對照組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。

表5 CCK-8 細胞增殖實驗統(tǒng)計CD4 +CD25 -細胞增殖率(%，±s)

表5 CCK-8 細胞增殖實驗統(tǒng)計CD4 +CD25 -細胞增殖率(%，±s)

組別 自體CD4 +CD25 - 異體CD4 +CD25-102.591 ±4.205 99.269 ±6.288健康對照組模型組100.000 ±6.593 100.000 ±3.143

討 論

1 型糖尿病被認(rèn)為是一種由于Tregs 數(shù)量或者功能遭到破壞而引起的自身免疫性疾病。Tregs 被認(rèn)為在維持免疫穩(wěn)態(tài)、預(yù)防自身免疫疾病方面發(fā)揮重要的作用，而轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 在功能性的Tregs 發(fā)生、維持以及發(fā)揮功能上起到關(guān)鍵作用［6，7］。早期有報道稱在糖尿病小鼠(NOD)外周血中占CD4+細胞5% ～10%的CD4+CD25+會出現(xiàn)數(shù)量減少的現(xiàn)象，后續(xù)對自發(fā)性糖尿病小鼠的系列試驗報道表明，Tregs 無論功能還是數(shù)量上的破壞都會導(dǎo)致1 型糖尿病的發(fā)生，而nTregs 和iTregs 都能阻止疾病的發(fā)生［8，9］。但對糖尿病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的數(shù)量和功能研究表明，CD4+CD25+Foxp3+的數(shù)量并未減少而是功能發(fā)生了改變，且Tregs 數(shù)量與年齡、病程具有相關(guān)性［10，11］。但是，對新患者(10 歲左右)的研究表明他們自身的Tregs 的數(shù)量和功能并未發(fā)生改變［12］。因此，自發(fā)性1 型糖尿病和Tregs 數(shù)量、功能的關(guān)系并未得到完全的證實，而是提示了兩者具有相關(guān)性［13］。

STZ 能夠選擇性破壞嚙齒類動物的胰腺胰島β細胞，從而使實驗動物產(chǎn)生糖尿病。本研究首先對使用STZ 造模后的實驗性1 型糖尿病大鼠和健康大鼠胸腺、脾臟、外周血中Tregs 的比例進行檢測。兩組剩余大鼠采用免疫磁珠兩步法(陰性選擇和陽性選擇)分選脾臟CD4+CD25+細胞，并檢測其對CD4+CD25-細胞增殖能力的抑制作用。文獻報道用免疫磁珠兩步法提取分離的大鼠脾臟CD4+CD25+細胞有較好的純度(87%)和存活率(97%)［14］。對實驗動物進行Tregs 數(shù)量和功能檢測，結(jié)果表明糖尿病大鼠Tregs 的功能和數(shù)量并未發(fā)生改變。筆者并不能完全排除隨著病程的進展，模型組大鼠Tregs 功能和數(shù)量會出現(xiàn)差異和改變，但根據(jù)目前STZ 導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)糖尿病致病機制的研究并未有明顯的與Tregs的功能和數(shù)量變化相關(guān)的提示，模型動物本身的改變也都是自身病程進展代償性的結(jié)果，而不是由于注射STZ 后對Tregs 造成嚴(yán)重影響，進而激發(fā)了自身免疫過程導(dǎo)致實驗動物出現(xiàn)1 型糖尿病［15，16］。本研究結(jié)果顯示使用STZ 造模的實驗型1 型糖尿病大鼠致病機制與Tregs 的數(shù)量和功能無直接相關(guān)性，與自發(fā)性1 型糖尿病模型和人患者有所區(qū)別，有助于闡明1 型糖尿病致病機制與Tregs 之間的關(guān)系。

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