循環(huán)腫瘤DNA與結(jié)直腸癌RAS、BRAF基因突變的相關(guān)性

陳飛 程祺 姜峰 隋殿晶

(吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)四科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

結(jié)直腸癌是全球常見高度惡性腫瘤之一，其發(fā)病率現(xiàn)已居第3位，腫瘤相關(guān)性死亡由于結(jié)直腸癌引發(fā)的已占9%左右〔1〕。近年來，隨著對(duì)腫瘤的研究不斷深入，基因檢測(cè)和靶向藥物治療已成為熱門領(lǐng)域，同時(shí)也對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存起到了一定改善作用〔2〕。目前對(duì)于結(jié)直腸癌的研究中RAS通路已趨于成熟，其中KRAS/BRAF/NRAS基因是常用檢測(cè)位點(diǎn)，且突變提示表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單抗類藥物耐藥，故國(guó)內(nèi)外各指南均推薦結(jié)直腸癌患者進(jìn)行RAS通路的位點(diǎn)檢測(cè)〔3，4〕。目前實(shí)際工作中對(duì)于基因的檢查僅通過活體腫瘤組織進(jìn)行，但組織活檢存在其自身的局限性，且無法克服腫瘤組織中存在的空間及時(shí)間異質(zhì)性〔5〕。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)主要指腫瘤細(xì)胞已釋放進(jìn)入血液循環(huán)中的DNA片段，被認(rèn)為包含有腫瘤組織的完整基因信息。ctDNA最大的優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)便、微創(chuàng)及動(dòng)態(tài)檢測(cè)，目前已成為基因檢測(cè)最熱門的樣本。既往諸多研究顯示〔6，7〕，ctDNA的檢測(cè)能夠?qū)Y(jié)直腸癌的預(yù)后及療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，但ctDNA與活體組織標(biāo)本所測(cè)DNA之間的差異研究較少，本研究旨在探討ctDNA與組織標(biāo)本DNA所測(cè)基因突變的一致性及其相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取吉林省腫瘤醫(yī)院2019年1月至2020年12月收治的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者61例。年齡30～78歲，中位年齡58歲；男38例，女23例；原發(fā)病部位左半結(jié)腸26例(42.6%)，右半結(jié)腸16例(26.2%)，直腸19例(31.1%)；轉(zhuǎn)移數(shù)：<2個(gè)34例(55.7%)，≥2個(gè)27例(44.3%)；肝轉(zhuǎn)移42例(68.9%)，無肝轉(zhuǎn)移19例(31.1%)；肺轉(zhuǎn)移27例(44.3%)，無肺轉(zhuǎn)移34例(55.7%)；盆腔轉(zhuǎn)移13例(21.3%)，無盆腔轉(zhuǎn)移48例(78.7%)；遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(18.0%)，無遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例(82.0%)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥30 歲；(2)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌，影像學(xué)證實(shí)存在1個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移灶；(3)能夠提供腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行KRAS、NRAS、BRAF 基因檢測(cè)；(4)不伴有其他原發(fā)腫瘤。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，所有患者及家屬對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本的采集及處理 在開始治療前抽取患者外周靜脈血10 ml， 放入專用的含EDTA抗凝血?jiǎng)┖图?xì)胞防腐劑的BCT管中，輕輕倒轉(zhuǎn)8～10次，常溫下保存和運(yùn)輸，2 h內(nèi)進(jìn)行離心處理。

1.2.2ctDNA的提取 參照DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行提取，提取好的DNA樣本，使用Qubit3.0熒光計(jì)檢測(cè)其濃度，濃度在2 ng/μl以上為合格。

1.2.3RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因檢測(cè) 應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行ctDNA及腫瘤組織標(biāo)本RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突變檢測(cè)，生成檢測(cè)報(bào)告。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行Kappa值符合率比較、χ2檢驗(yàn)及多因素回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1患者基因突變情況 61例患者腫瘤組織基因突變檢測(cè)結(jié)果：KRAS突變型患者26例(42.6%)，野生型35例(57.4%)；NRAS突變型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)BRAF突變型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)；61例患者血漿ctDNA基因突變結(jié)果：KRAS基因突變型患者21例(34.4%)，野生型40例(65.6%)；NRAS突變型3例(4.9%)，野生型58例(95.1%)；BRAF突變型患者4例(6.6%)，野生型57例(93.4%)。

2.2兩種方法結(jié)果一致性比較 KRAS：血漿ctDNA與組織檢測(cè)突變結(jié)果對(duì)比，KRAS突變型一致性為 85.2%(Kappa=0.831，P<0.05)，靈敏度 73.1%，特異性94.3%。NRAS：血漿ctDNA與組織檢測(cè)突變結(jié)果對(duì)比，NRAS突變型一致性為 93.4%(Kappa=0.769，P<0.05)，靈敏度40.0%，特異性98.2%。BRAF：血漿ctDNA與組織檢測(cè)突變結(jié)果對(duì)比,BRAF突變型一致性為 95.1%(Kappa=0.833，P<0.05)，靈敏度60.0%，特異性98.2%。

2.3影響一致性的因素分析 兩組方法在檢測(cè)基因位點(diǎn)突變時(shí)，一致率較高，單因素分析結(jié)果顯示，初診治療情況是影響一致性的因素(P<0.05)，見表1。將單因素分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，初診治療情況及肝轉(zhuǎn)移是影響兩種方法檢測(cè)一致性的因素，見表2。

表1 影響一致性的單因素分析〔n(%)〕

表2 多因素回歸分析

3 討 論

隨著腫瘤發(fā)病率的增加及對(duì)腫瘤研究的不斷深入，諸多研究已報(bào)道結(jié)直腸癌的發(fā)病與基因突變存在密切相關(guān)性〔8，9〕，基于基因檢測(cè)的腫瘤分子分型及個(gè)體化治療方案已成為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的常規(guī)治療模式。結(jié)直腸癌基因檢測(cè)取材于腫瘤組織，組織獲取為有創(chuàng)性操作，在同一例患者無法反復(fù)多次進(jìn)行。循環(huán)腫瘤DNA基因檢測(cè)是一項(xiàng)非侵入式檢測(cè)的“液體活檢”技術(shù)。本研究通過ddPCR法檢測(cè)了61例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA及腫瘤組織中RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突變情況，結(jié)果與既往研究中的一致率接近(89%～93%)〔10〕。兩種方法對(duì)于突變基因檢測(cè)的結(jié)果仍存在一定不一致性，其受到多種因素的影響，首先兩種方法所選用的標(biāo)本采集時(shí)間不完全相同，其次本研究患者在進(jìn)行血漿ctDNA的檢測(cè)時(shí)已進(jìn)行了相關(guān)抗腫瘤治療，會(huì)導(dǎo)致血漿中ctDNA濃度下降，最終使得結(jié)果存在一定偏倚。最后ctDNA對(duì)于基因突變的檢測(cè)靈敏度較高，也可能出現(xiàn)了活體組織中在低豐度未檢測(cè)出的位點(diǎn)在ctDNA檢測(cè)中呈現(xiàn)出陽(yáng)性的情況〔11，12〕。另一方面，不同腫瘤組織間，原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶不同轉(zhuǎn)移灶之間存在腫瘤異質(zhì)性，也是導(dǎo)致兩種方法檢查結(jié)果不一致的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，存在組織基因野生且經(jīng)過抗EGFR治療后，經(jīng)ctDNA檢測(cè)KRAS、BRAF、NRAS發(fā)生突變，與既往報(bào)道結(jié)果相似〔13〕。結(jié)果進(jìn)一步提升，在接受抗EGFR治療期間，通過對(duì)ctDNA的檢測(cè)能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)藥物的耐藥性，所有位點(diǎn)基因中最為常見的突變?yōu)镵RAS突變。既往研究也發(fā)現(xiàn)〔14〕，經(jīng)過動(dòng)態(tài)的ctDNA連續(xù)性監(jiān)測(cè)，能夠觀察到抗EGFR藥物治療后會(huì)誘發(fā)KRAS的突變，在停止治療后，突變的豐度也會(huì)隨之下降及消失，若再次恢復(fù)治療可獲得一定收益。故而對(duì)于ctDNA進(jìn)行動(dòng)態(tài)的連續(xù)性監(jiān)測(cè)能夠更加準(zhǔn)確地對(duì)靶向治療進(jìn)行指導(dǎo)〔15，16〕。本研究發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者居多，且有半數(shù)以上患者伴有其他部位轉(zhuǎn)移，此部分患者則存在腫瘤負(fù)荷較高的情況，故而對(duì)于肝轉(zhuǎn)移患者的不同方法檢測(cè)，一致率較高。既往研究表明〔17〕，ctDNA的水平與相關(guān)腫瘤負(fù)荷存在密切相關(guān)性，當(dāng)腫瘤負(fù)荷較低時(shí)，ctDNA出現(xiàn)假陰性的概率較高，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性也更低。

綜上，兩種方法對(duì)于結(jié)直腸癌患者基因突變檢測(cè)一致性較高，導(dǎo)致不一致的主要原因可能與既往診療情況有密切關(guān)系。本研究仍存在一定不足，首先本研究?jī)H為單中心研究，納入樣本量較?。黄浯螌?duì)于患者后續(xù)未進(jìn)行相關(guān)隨訪，未能夠?qū)煞N方法檢測(cè)不一致的患者進(jìn)行預(yù)后追蹤。下一步仍需進(jìn)行多中心及大樣本量的臨床研究。