鹽酸二氧丙嗪及其與β－環(huán)糊精包絡(luò)作用的熒光分析法研究

施 紅，劉 娥，張華新

（荊楚理工學(xué)院化工與藥學(xué)院，湖北 荊門448000）

鹽酸二氧丙嗪（dioxopromethazine，DOPM），是一種主要作用于呼吸系統(tǒng)的新藥，其鎮(zhèn)咳藥效約為可待因的6～11倍，兼具祛痰、平喘、抗組胺、解除平滑肌痙攣、抗炎和局部麻醉等作用，無耐藥性和成癮性，臨床適用于急、慢性支氣管炎引起的咳嗽、過敏性哮喘、蕁麻疹、皮膚瘙癢等癥［1－2］。目前鑒別DOPM的方法僅有薄層色譜法［3］和紫外分光光度法［4］，測定DOPM含量的方法鮮有報道。

β－環(huán)糊精（β－cyclodextrin，β－CD），由7個葡萄糖單元以1，4－糖苷鍵結(jié)合而成，具有特殊的強(qiáng)疏水性空腔結(jié)構(gòu)，當(dāng)客體分子尺寸和性質(zhì)與其空腔相匹配時，可以借助范德華力、疏水作用力等包絡(luò)多種客體分子（整個分子、分子的一部分或某些官能團(tuán)）形成包絡(luò)物［5］。研究表明，β－CD與DOPM可以在一定條件下發(fā)生包絡(luò)反應(yīng)，而且在不同的濃度比下，β－CD對DOPM分別表現(xiàn)出熒光增敏作用和熒光猝滅作用。

作者在提出DOPM熒光分析方法的同時，著重研究了不同溫度下β－CD對DOPM的熒光猝滅作用，分別用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)方程和Benesi－Hildebrand方程處理相對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計算靜態(tài)猝滅常數(shù)、β－CD－DOPM體系的平衡常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)等，并對包絡(luò)作用機(jī)理進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

DOPM，中國藥品生物制品檢定所；β－CD、三羥甲基氨基甲烷，上海三浦化工有限公司；200mg·L－1DOPM標(biāo)準(zhǔn)儲備液；2mg·L－1、8mg·L－1DOPM工作液；0.015mol·L－1β－CD溶液；三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（Tris－HCl）緩沖溶液（pH＝7.40）。

LS－55型分子熒光光度計，Perkin－Elmer公司；AY－120型電子分析天平，Shimadzu公司；SYC－15型恒溫水?。ň取?.1℃），南京桑力電子設(shè)備廠；PHS－3C型pH計（精度±0.01），上海精密儀器有限公司。

1.2 方法

準(zhǔn)確移取適量DOPM工作液于10mL比色管中，用二次蒸餾水定容，搖勻，靜置30min。在激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度分別為15nm和5nm、λex＝227nm、掃描速率為1 200nm·min－1的條件下掃描DOPM溶液的熒光光譜。

另取一定量DOPM工作液于10mL比色管中，加入適量的β－CD溶液后定容，于相同條件下掃描β－CD－DOPM體系的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜分析（圖1）

圖1 DOPM及β－CD－DOPM體系的熒光激發(fā)光譜（a）和熒光發(fā)射光譜（b）Fig.1 Fluorescence excitation（a）and fluorescence emission（b）spectra of DOPM andβ－CD－DOPM system

由圖1可看出：加入適量β－CD后，DOPM熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的強(qiáng)度都有所增強(qiáng)，表明β－CD對DOPM有一定的熒光增敏作用；β－CD－DOPM體系的熒光發(fā)射波長明顯紫移，由364nm移至343nm（圖1b），這是β－CD－DOPM包絡(luò)物形成的重要標(biāo)志。

2.2 β－CD對DOPM的熒光猝滅作用

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)β－CD與DOPM濃度比大于10 000∶1時，β－CD對DOPM略有增敏作用；當(dāng)β－CD與DOPM濃度比小于5 000∶1時，β－CD對DOPM表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光猝滅作用，如圖2所示。

由圖2可看出，隨著β－CD濃度的增加，DOPM的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，可見β－CD對DOPM的熒光產(chǎn)生猝滅作用。

2.3 pH值及溫度對DOPM熒光強(qiáng)度的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：DOPM在pH＝3～10的Tris－HCl緩沖溶液中基本穩(wěn)定，中性時熒光強(qiáng)度較大，因此，本實(shí)驗(yàn)不必加入緩沖溶液。

圖2 β－CD－DOPM體系的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra ofβ－CD－DOPM system

同時還發(fā)現(xiàn)：在20～30℃范圍內(nèi)，溫度對DOPM熒光強(qiáng)度影響很小。

2.4 工作曲線及檢出限（圖3）

圖3 DOPM的熒光發(fā)射光譜（a）和工作曲線（b）Fig.3 Fluorescence emission spectra（a）and work curve（b）of DOPM

由圖3b可看出，DOPM濃度在0～1.0×10－6mol·L－1時，與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。工作曲線的線性方程為F＝2.352×108cDOPM＋101.7，相關(guān)系數(shù)R＝0.9991。根據(jù)IUPAC的規(guī)定，該法對DOPM的檢出限為1.001×10－7mol·L－1，平均回收率為99.1%。

2.5 包絡(luò)作用的熱力學(xué)參數(shù)計算

297K、307K下，加入β－CD前后DOPM熒光強(qiáng)度的變化情況如圖4所示。

圖4 DOPM的Stern－Volmer曲線（a）和Lineweaver－Burk雙倒數(shù)曲線（b）Fig.4 Stern－Volmer curves（a）and Lineweaver－Burk double－reciprocal curves（b）of DOPM

根據(jù)動態(tài)猝滅機(jī)理的Stern－Volmer方程和靜態(tài)猝滅機(jī)理的Lineweaver－Burk方程，對相對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1。

表1 Stern－Volmer和Lineweaver－Burk曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equation and correlation coefficient of Stern－Volmer and Lineweaver－Burk curves

從表1可看出，β－CD對DOPM的猝滅作用更符合Lineweaver－Burk方程，主要屬于靜態(tài)猝滅。

當(dāng)溫度變化不大時，化學(xué)反應(yīng)的焓變ΔHθ可近似看成一個常數(shù)，由熱力學(xué)方程ΔGθ＝－RTlnKθ、ln（K／K）＝（ΔHθ／R）·（1／T1－1／T2）和ΔGθ＝ΔHθ－T·ΔSθ計算有關(guān)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表2 β－CD與DOPM的結(jié)合常數(shù)KLB和熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Binding constant ofβ－CD with DOPM and thermodynamic parameters

Benesi－Hildebrand法是測定包絡(luò)物形成常數(shù)的經(jīng)典方法。設(shè)cS為客體的總濃度，ΔF為加入β－CD前后熒光強(qiáng)度的變化，α為常數(shù)，根據(jù)1／ΔF＝Kf／（α·cS·cβ－CD）＋1／（α·cS）可測得不同β－CD濃度下DOPM的熒光強(qiáng)度F，以1／ΔF對1／cβ－CD作圖，由直線的斜率和截距即可求出包絡(luò)物的Kf。按此法分別求出了297 K、307K時包絡(luò)物的形成常數(shù)Kf，并由熱力學(xué)方程計算出了相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果與表2數(shù)據(jù)一致。

2.6 β－CD與DOPM的包絡(luò)作用機(jī)理探討

當(dāng)β－CD與DOPM濃度比大于10 000∶1時，β－CD與DOPM發(fā)生的包絡(luò)作用比較充分，β－CD－DOPM包絡(luò)物形成后，改變了DOPM分子周邊的微環(huán)境，起到了固定客體分子、減少碰撞、擴(kuò)大吸光面的作用，提高了DOPM的熒光量子產(chǎn)率，表現(xiàn)為熒光增敏作用；ΔG＜0（表2）說明包絡(luò)反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行，且溫度越高自發(fā)程度越大；同時Kf較大，且隨溫度升高而增大，也是上述結(jié)論的有力佐證；當(dāng)β－CD與DOPM濃度比小于5 000∶1時，β－CD與DOPM的包絡(luò)作用不完全，體系不穩(wěn)定，能量容易從DOPM轉(zhuǎn)移到β－CD分子上去，因而導(dǎo)致DOPM熒光強(qiáng)度減弱，表現(xiàn)為熒光猝滅作用。

3 結(jié)論

采用熒光光譜法研究了DOPM的熒光現(xiàn)象及其與β－CD的包絡(luò)作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)β－CD與DOPM濃度比大于10 000∶1時，β－CD對DOPM有一定的熒光增敏作用，當(dāng)β－CD與DOPM濃度比小于5 000∶1時，β－CD對DOPM有較強(qiáng)的熒光猝滅作用；提出了測定DOPM含量的熒光光譜分析新方法，該法的檢出限為1.001×10－7mol·L－1，平均回收率為99.1%；利用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)方程和Benesi－Hildebrand方程分別處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到了β－CD與DOPM包絡(luò)作用的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，并對包絡(luò)作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討。

［1］周自永，王世祥.新編常用藥物手冊［M］.第三版.北京：金盾出版社，2002：317.

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