三色堇小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的解剖學研究

王曉磊，徐永清，王瑩，胡寶忠*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱學院體育學院，哈爾濱 150086；3.哈藥集團技術中心，哈爾濱 150025）

三色堇小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的解剖學研究

王曉磊1,2，徐永清1，王瑩3，胡寶忠1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱學院體育學院，哈爾濱 150086；3.哈藥集團技術中心，哈爾濱 150025）

運用石蠟切片法對三色堇（Viola tricolor L.）小孢子發(fā)生及雄配子體形成進行研究。結(jié)果表明，三色堇成熟的花藥有4個小孢子囊，花藥壁發(fā)育為基本型，共6～7層，從外至內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，絨氈層發(fā)育類型為腺質(zhì)絨氈層。小孢子母細胞減數(shù)分裂為連續(xù)型，四分體呈四面體型排列。成熟花粉為2-細胞型或3-細胞型，在一個橫切面上最多具有5個萌發(fā)孔。

三色堇；小孢子發(fā)生；雄配子體

三色堇（Viola tricolor L.）屬堇菜科堇菜屬多年生草本花卉。原產(chǎn)歐洲，我國于20世紀20年代初引進，全國各地均有栽培[1]，可用作庭院、花壇、景區(qū)栽培及盆栽。三色堇可全草入藥，具清熱解毒、散瘀、止咳等功能，用于治療小兒瘰疬、咳

嗽及呼吸道炎癥等疾患[2]。三色堇中含蕓香甙、類胡蘿素類、揮發(fā)性精油、花青素等組分，是生產(chǎn)化妝品重要活性成分。近年來，學者對三色堇研究主要集中在栽培育種[3-5]、抗性生理[6-10]、親緣關系[11-12]和性狀分析[13-15]等方面。對三色堇花粉形態(tài)和培養(yǎng)[16-19]、組織培養(yǎng)[20-21]、核型分析等[22-33]方面開展研究。但有關生殖生物學研究尚無報道，植物生殖成功是物種繁衍和生存保證，本文利用光鏡觀察三色堇小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育，以期為三色堇在生殖生物學和發(fā)育生物學研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為東北農(nóng)業(yè)大學苗圃三色堇。

1.2 方法

采樣時間為2011～2012年5～10月。用手術刀切掉花梗后，把不同發(fā)育階段的三色堇花芽及開放的花蕾立即固定在固定液中，固定液為FAA [70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林（38%甲醛）5 mL]，然后帶回實驗室。在室溫下保存，試驗材料經(jīng)酒精逐級脫水，二甲苯置換，包埋于石蠟中。采用常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度為6～8 μm，加拿大樹膠封片，染色方法為愛氏蘇木精整染法和番紅-固綠雙染法,光學顯微鏡下觀察花藥發(fā)育過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥壁的發(fā)育

三色堇開花早，花期長，花為兩性花，花瓣5枚；雄蕊5個，花藥圍繞子房排列成一環(huán)，下方的兩個雄蕊基部有距狀的蜜腺，屬于雄蕊蜜腺，為花藥下端藥隔的棒狀延伸物。成熟花藥具有4個花粉囊。在橫切面上，三色堇初期的花藥為橢圓形，最外面是一層表皮，在表皮下是一群分裂活躍排列緊密的細胞。隨著花藥的發(fā)育，在花藥四個角隅處的細胞分裂較快，分化出孢原細胞。孢原細胞經(jīng)過一次平周分裂，形成兩層細胞，外層的細胞為初生壁細胞，內(nèi)層的細胞為初生造孢細胞。初生壁細胞進行垂周分裂和平周分裂，形成環(huán)繞初生造孢細胞的一層細胞。在經(jīng)過兩次連續(xù)的平周分裂后，此層細胞分化成4層細胞。從外到內(nèi)依次是藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層細胞。因此，三色堇成熟的花藥壁共6～7層（見圖版Ⅰ-1,2），從外到內(nèi)分別是表皮1層，藥室內(nèi)壁1層，中層2～4層，絨氈層1層，其發(fā)育方式為基本型。分化初期時花藥壁的幾層細胞在形態(tài)上差別不大，隨著花藥的發(fā)育，藥壁各層細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化。表皮細胞最初是1層近等徑的細胞，細胞質(zhì)濃厚，細胞核大，隨著花藥的發(fā)育，表皮細胞逐漸變得扁平，在細胞外壁上具有明顯的角質(zhì)層。當花藥成熟時，表皮細胞仍然存在于最外層，但形態(tài)變得不規(guī)則并且逐漸瓦解，在整個發(fā)育過程中，表皮細胞只進行垂周分裂。

圖版Ⅰ 花藥壁的發(fā)育PlateⅠ Development of anther wall

藥室內(nèi)壁由1層細胞構(gòu)成，在形成小孢子母細胞階段，藥室內(nèi)壁的細胞壁上開始形成不同程度的帶狀徑向加厚；單核花粉粒時期，細胞由近正方形變?yōu)閺较蜓娱L；在花藥成熟時，細胞呈柵欄狀排列。藥室內(nèi)壁細胞在加厚時，在兩個花粉囊交接處留下一條不發(fā)生加厚的區(qū)域，當花藥成熟時，在此處開裂散出花粉粒。

中層位于藥室內(nèi)壁的內(nèi)側(cè)，由2～4層細胞構(gòu)成，在細胞形態(tài)上與藥室內(nèi)壁無明顯差別。小孢子母細胞階段，中層細胞變扁平，然后逐漸瓦解并被吸收。當花藥成熟時中層細胞完全消失。

絨氈層細胞是由初生壁細胞發(fā)育成的，屬腺質(zhì)絨氈層。剛分化形成的絨氈層細胞是單核的，隨著花藥的發(fā)育，絨氈層細胞進行有絲分裂，但在分裂過程中不形成細胞板，使形成的兩個二倍體子核保留在一個細胞內(nèi)，使細胞具有雙核；其中有的繼續(xù)分裂成具多核的細胞。當絨氈層發(fā)育到最高程度時，其細胞比藥壁的其他細胞大，細胞質(zhì)變濃厚，液泡變小并且變少，細胞排列緊密為二核或多核的細胞，在花藥橫切面上看呈近方形且排列成規(guī)則的環(huán)形。絨氈層表面能分泌各種物質(zhì)為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)。小孢子發(fā)育階段，絨氈層開始表現(xiàn)出明顯的解體跡象，細胞體積變小且扁平（見圖版Ⅰ-3）；當花粉成熟后，絨氈層細胞完全自溶。因此成熟的花藥壁僅剩下表皮細胞和藥室內(nèi)壁兩層細胞（見圖版Ⅰ-4,5）。

2.2 小孢子的發(fā)生

孢原細胞（見圖版Ⅱ-1）經(jīng)過平周分裂形成初生壁細胞和初生造孢細胞（見圖版Ⅱ-2，3），隨著藥壁的分化，初生造孢細胞進行有絲分裂形成多個排列緊密的次生造孢細胞（見圖版Ⅱ-4），次生造孢細胞呈四邊形，細胞核大且細胞質(zhì)濃厚，次生造孢細胞長大、變圓直接發(fā)育成小孢子母細胞（見圖版Ⅱ-5）。小孢子母細胞的數(shù)量相對較少，在一個橫切面上最多不超過10個。小孢子母細胞為圓形，細胞體積大，細胞核大且核仁明顯，細胞質(zhì)濃厚但無液泡。小孢子母細胞不斷長大并進入減數(shù)分裂期（見圖版Ⅱ-6,7），經(jīng)過兩次減數(shù)分裂形成四分體。觀察表明，在減數(shù)分裂時，小孢子母細胞第一次減數(shù)分裂形成兩個有細胞壁的二分體（見圖版Ⅱ-8）。經(jīng)過短暫的分裂間期，進行第二次減數(shù)分裂并形成四面體型的四分體（見圖版Ⅱ-9）。因此，小孢子母細胞減數(shù)分裂過程所發(fā)生的胞質(zhì)分裂為連續(xù)型。

2.3 雄配子體的發(fā)育

新形成的小孢子四分體被胼胝質(zhì)壁所包圍，隨著花藥的發(fā)育胼胝質(zhì)壁消失，小孢子四分體分散開，剛散開的小孢子形狀近球形，細胞質(zhì)濃厚，無液泡，位于中央的細胞核較大，外壁加厚明顯，發(fā)育成單核花粉粒（見圖版Ⅱ-10）。隨著小孢子體積的不斷增大，細胞質(zhì)發(fā)生液泡化，在小孢子的中央逐漸形成一個大液泡，細胞質(zhì)呈一薄層貼著細胞壁，細胞核也從中央移到細胞的一側(cè)，此時期為單核靠邊期（見圖版Ⅱ-11）。接著單核靠邊的小孢子進行一次不均等的有絲分裂，形成兩個大小懸殊的細胞，大的是營養(yǎng)細胞，包含原來小孢子的大部分細胞質(zhì)和液泡；小的是生殖細胞，只有少量的細胞質(zhì)，細胞呈凸透鏡狀，靠近花粉壁。此后，生殖細胞脫離花粉的壁，游離在營養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中，有的生殖細胞進行一次有絲分裂形成兩個精子。因此三色堇成熟的花粉粒以2-細胞型為主（見圖版Ⅱ-12），兼有少量的3-細胞型花粉（見圖版Ⅲ-1～3）。

在花藥的切片中觀察到，三色堇的5個花藥在發(fā)育初期具有不同步性。位于上方的3個花藥發(fā)育早于下方的兩個花藥（見圖版Ⅲ-4,5），當下方的兩個花藥四分體剛分開不久，小孢子細胞質(zhì)液泡化，形成一薄層貼著細胞壁，在中央逐漸形成一個大液泡，細胞核也從中央移到一側(cè)時，上方的3個花藥已發(fā)育到2-細胞型花粉時期。

2.4 花粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)

成熟花粉粒的特點是花粉粒數(shù)量少且體積大，花粉內(nèi)的營養(yǎng)核和生殖細胞較大。隨著花藥發(fā)育，花粉粒內(nèi)積累大量淀粉粒和脂肪，使花粉粒呈球形，在一個平面上最多能看到5個萌發(fā)孔（見圖版Ⅲ-3）。

2.5 小孢子及雄配子體發(fā)育與絨氈層細胞發(fā)育的關系

絨氈層細胞的細胞質(zhì)濃厚，含較多的RNA和蛋白質(zhì)，還有豐富的油脂和類胡蘿卜素等，能為小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)?，F(xiàn)將小孢子及雄配子體與絨氈層細胞發(fā)育的關系歸納為表1。

圖版Ⅱ 小孢子的發(fā)生與雄配子體的發(fā)育PlateⅡ Microsporogenesis and male gametophyte development

圖版Ⅲ 花粉和不同步發(fā)育的花藥PlateⅢ Pollen and different developments of anther

表1 小孢子及雄配子體與絨氈層細胞發(fā)育的相互關系Table 1 Interrelation of development of microspore and antheridium with tapetum

3 討論與結(jié)論

一般植物的花瓣等大，排列整齊，花藥發(fā)育具有同步性。本研究在花藥切片中發(fā)現(xiàn)，三色堇5個花藥開始發(fā)育過程不同步。位于上方的3個花藥發(fā)育早于下方兩個花藥，當下方兩個花藥四分體剛分開不久，小孢子細胞質(zhì)液泡化，形成一薄層貼著細胞壁，在中央逐漸形成一個大液泡，細胞核也從中央移到一側(cè)時，上方3個花藥已發(fā)育到2-細胞型花粉時期。這種現(xiàn)象在其他植物中也有發(fā)現(xiàn)[24-26]。胡適宜等認為，同一花粉囊的小孢子母細胞之間存在細胞質(zhì)聯(lián)絡通道，使整個小孢子囊的小孢子母細胞形成一個合胞體，有助于細胞間物質(zhì)均衡分布，也保證減數(shù)分裂具有很高同步性[27]。然而對同一花中不同花藥發(fā)育的不同步現(xiàn)象，潘開玉等認為，這是植物延長傳粉期進而適應環(huán)境的現(xiàn)象[28]。三色堇花藥發(fā)育不同步現(xiàn)象，除為了延長傳粉期，還可能和三色堇花的形態(tài)特征有關。下方的兩個花藥由于位于子房的下方，發(fā)育過程中受到子房的擠壓；在下方的兩個雄蕊基部有距狀的蜜腺，在這兩方面因素共同作用下，造成三色堇花藥發(fā)育不同步。是否還有其他因素，有待進一步研究。孫坤、李方等觀察到堇菜屬的花粉為長球形[16,18]，近球形或球形，三色堇的花粉為5孔溝。本研究也發(fā)現(xiàn)三色堇的花粉為球形，在一個平面上最多能看到5個萌發(fā)孔，這與孫坤等[16]研究結(jié)果基本一致。

三色堇的雄蕊具有4個花粉囊,花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層組成,中層位于藥室內(nèi)壁的內(nèi)側(cè)，由2～4層細胞構(gòu)成，四分體呈正四面體形，這些特征與韋仲新等[29]對堇菜科植物花藥特征的描述基本一致。韋仲新等總結(jié)堇菜科植物絨氈層為分泌型，細胞為雙核的細胞，小孢子母細胞減數(shù)分裂為同時型,花粉粒為2-細胞型。而本試驗中觀察到，三色堇的絨氈層為腺質(zhì)絨氈層，細胞有的為雙核細胞，有的為多核細胞[29]。小孢子母細胞減數(shù)分裂為連續(xù)型,花粉粒以2-細胞型為主，兼有少量的3-細胞型，花藥壁的發(fā)育方式為基本型。這些特征，可豐富堇菜科植物生殖生物學研究。

[1]郭兆武,蕭浪濤.6-BA和GA3促進三色堇再生的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版,2002,28(6):499-501.

[2]姚振生,傅騫峰,曹嵐.江西省堇菜屬藥用植物資源及利用[J].江西科學,2001,19(2):104-107.

[3]陶玉祥.三色堇日光溫室雜交制種技術[J].種子科技,2012(3): 32-33.

[4]趙宇,牛常青,趙坤.三色堇對粉煤灰-醋糟基質(zhì)的適應性探究[J].中國農(nóng)學通報,2012,28(1):171-175.

[5]劉紅玉,李方華.酒泉地區(qū)溫室三色堇雜交制種技術[J].上海蔬菜,2012(3):15-16.

[6]羅玉蘭,陸亮,王泰哲.本地和荷蘭三色堇抗寒性的比較[J].植物生理學通訊,2001,37(1):27-28.

[7]尤揚,賈文慶.NaCI脅迫對三色堇SOD、POD及葉綠素含量的影響[J].北方園藝,2012(6):64-66.

[8]杜曉華,劉會超,袁少寒,等.三色堇花期光合生理生態(tài)特征[J].西南林業(yè)大學學報,2011(3):7-12.

[9]朱永興,韓春葉,白志懷.干旱脅迫對盆栽三色堇生理指標的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2013,42(8):109-111.

[10]彭華婷,高悅,杜紅梅,等.高溫脅迫對大花三色堇幼苗相關生理指標的影響[J].上海交通大學學報:農(nóng)業(yè)科學版,2012,30 (6):66-70.

[11]王濤,徐進,張西西,等.43份三色堇、角堇材料親緣關系的SRAP分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2012,45(3):496-502.

[12]杜曉華,劉會超,劉孟剛,等.33個三色堇品種遺傳差異的初步分析[J].西北林學院學報,2010,25(4):78-82.

[13]杜曉華,劉會超,姚連芳.三色堇觀賞性狀的主成分分析[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2011,20(6):136-140.

[14]杜曉華,劉會超,朱方方,等.基于主成分的三色堇聚類分析[J].北方園藝,2011(5):180-184.

[15]盧興霞,胡惠蓉,王健.花三色堇自交系主要數(shù)量性狀配合力分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2013,36(1):11-15.

[16]孫坤,王漪,王曉東,等.國產(chǎn)堇菜屬花粉形態(tài)的研究[J].植物研究,1994,14(1):81-87.

[17]李春燕,李清斌,程振,等.大花三色堇和三色堇花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基研究[J].北方園藝,2011(3):54-56.

[18]李方,尹祖棠.堇菜屬植物花粉及葉表皮超微形態(tài)多樣性的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2000,5(3):6-12.

[19]周玉敏,徐自警.三色堇花粉生活力的測定[J].中國林副特產(chǎn),2012,4,28-29.

[20]姚立平.三色堇組織培養(yǎng)技術研究[J].遼寧林業(yè)科技,2012(2): 26-27.

[21]王振民,付強,趙兵.三色堇組培快繁技術研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學,2011(1):43-45.

[22]穆金艷,杜曉華,劉會超.大花三色堇的核型分析[J].東北林業(yè)大學學報,2013,41(7):75-78.

[23]何麗君,周小燕.三色堇染色體核型分析[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報,2007,28(6):200－204.

[24]曹清河,陳勁楓,錢春桃,等.黃瓜花粉母細胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育的細胞學研究[J].西北植物學報,2004,24(9): 1721-1726.

[25]盧立娜,賀曉,易津,等.華北駝絨藜大小孢子的發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程的解剖學研究[J].西北植物學報,2008,28(7): 1319-1325.

[26]高建平,賀曉,郭春燕,等.蒙古蕕小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的研究[J].西北植物學報,2009,29(6):1149-1154.

[27]胡適宜.被子植物學生殖生物學[M].北京:高等教育出版社,2005:33-34.

[28]潘開玉,溫潔,周世良.石香薷(唇形科)的胚胎學研究[J].植物學報,1997,39(2):111-116.

[29]韋仲新,金巧軍.西域旌節(jié)花的雌雄配子體發(fā)育及其系統(tǒng)學啟示[J].云南植物研究,2002,24(6):733-742.

Anatomical studies on microsporogenesis and development of male gametophyte in pansy

WANG Xiaolei1,2,XU Yongqing1,WANG Ying3,HU Baozhong1
（1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Physical Education,Harbin University,Harbin 150086,China;3.Harbin Pharmaceutical Group R&D Center,Harbin 150025,China)

The microsporogenesis and development of male gametophyte of pansy(Viola tricolorL.) were studied with the method of general paraffin section technology.The results showed that the mature anther of pansy had four microsporanges.The growth of the anther wall with six or seven layers belonged to tetrahedron type.The layers from the inside out of anther wall were epiderm,endothecium,middle layer and secretory glandular tapetum of pansy successively.The cytokinesis division of the microspore mother cell was successive type and the tetrad was tetrahedron type.Mature pollen was 2-celled or 3-celled which had five germinal pores.

pansy;microsporogenesis;male gametophyte

S681.9

A

1005-9369（2014）04-0060-06

2013-09-29

黑龍江省自然科學基金（C2008049）；國家國際科技合作項目子課題（2013DFR30270）

王曉磊（1978-），女，講師，博士，研究方向為植物分子生物學。E-mail:wxlei9234@163.com

*通訊作者：胡寶忠，教授，博士生導師，研究方向為植物分子生物學。E-mail:bzhu@neau.edu.cn

時間2014-4-21 13:25:43[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1326.036.html

王曉磊,徐永清,王瑩,等.三色堇小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的解剖學研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(4)∶60-65.

Wang Xiaolei,Xu Yongqing,Wang Ying,et al.Anatomical studies on microsporogenesis and development of male gametophyte in pansy[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶60-65.(in Chinese with English abstract)