酶水解對大豆致敏蛋白P34免疫活性的影響及酶解產(chǎn)物理化性質(zhì)研究

鄭環(huán)宇，白小娟，張麗麗，董小超，許慧，韓建春，朱秀清

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省大豆技術開發(fā)研究中心，哈爾濱 150030）

酶水解對大豆致敏蛋白P34免疫活性的影響及酶解產(chǎn)物理化性質(zhì)研究

鄭環(huán)宇1,2，白小娟1，張麗麗1，董小超1，許慧2，韓建春1,2，朱秀清1,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省大豆技術開發(fā)研究中心，哈爾濱 150030）

采用不同來源的7種蛋白酶對大豆蛋白進行酶解，利用SDS-PAGE和水解度研究酶解去除P34的效果，通過Western Blot法測定酶解后大豆致敏蛋白P34免疫活性的變化。結(jié)果表明，經(jīng)不同來源的蛋白酶處理后，大豆蛋白中致敏蛋白P34的含量都有不同程度降低，風味蛋白酶和堿性蛋白酶對P34的作用效果最強，可將P34完全去除。在最優(yōu)的酶解條件下，兩種大豆蛋白酶解物溶解性、保水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性明顯提高，而粘性、吸油性和泡沫穩(wěn)定性降低。

大豆；大豆致敏蛋白P34；酶水解；理化性質(zhì)

大豆蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白源，不但具有豐富的蛋白質(zhì)和與人體需求相平衡的氨基酸組成，而且還具有水溶性、脂溶性、乳化性、發(fā)泡性等功能特性，適于多種食品加工，但大豆蛋白中也含有一些致敏性蛋白。大豆致敏蛋白可以引起皮膚瘙癢、紅腫、呼吸困難、昏厥甚至危及生命。調(diào)查表明美國約有0.5%的人對大豆過敏[1]，而我國至今還沒有大豆過敏人群的統(tǒng)計數(shù)字，在大豆過敏源方面的研究也相對較少。根據(jù)過敏源在線數(shù)據(jù)庫的報道[2]。已在大豆中發(fā)現(xiàn)38種致敏蛋白。在這些致敏蛋白中，大豆致敏蛋白P34被稱為大豆致敏蛋白Gly m Bd 30 K，屬于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族邊緣成員，是一種糖蛋白，糖基化位點位于成熟蛋白第170位天冬酰胺處，多糖組成為甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖、木糖，比例分別為3∶2∶1∶1[3-4]。P34結(jié)構(gòu)由3對保守二硫鍵穩(wěn)定，主要由α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)域組成[5]。研究表明P34是大豆中的主要致敏蛋白[6-7]，易引發(fā)過敏性皮炎，其特異性IgE抗體識別率高達65%[8]，因此研究如何去除P34對降低大豆蛋白的致敏性具有重要意義。

本研究選取不同來源的七種蛋白酶對大豆分離蛋白進行酶解，通過對大豆致敏蛋白P34含量和大豆分離蛋白水解度比較，篩選出降解大豆致敏蛋白P34能力最強的酶種類，優(yōu)化出消除P34致敏性的最佳酶解工藝條件，對最佳酶解條件下酶解物的功能特性進行研究。旨在為生產(chǎn)低致敏性大豆蛋白產(chǎn)品及其應用提供理論參考。低致敏性大豆蛋白不但可解決敏感人群食用大豆蛋白過敏問題，也為生產(chǎn)豆基嬰幼兒配方粉代替動物乳品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)含量92.5%）購自哈高科大豆食品有限公司；丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸（Gly）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、牛血清白蛋白、預染的蛋白Marker（14.4～97.4 kDa）、4-Chloro-1-Naphthol，均購自Sigma公司；一次抗體：F5（NICS，Japan），二次抗體: IgG（H+L）（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG（H +L）均購自Bioss Inc公司。木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，均購自諾維信公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器

DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、DYY-24D型電泳槽（北京六一儀器廠）、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）、GL-20B高速冷凍離心機（上海安亭實驗儀器廠）、FD-1D-50型真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、水浴恒溫搖床（上海天呈儀器廠）、水平搖床（北京六一儀器廠）、FJ200型高速分散均質(zhì)機（上海標本模型廠）、凱氏定氮儀（上海玻璃儀器廠）、PHS-3C型酸度計（上海雷磁儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白致敏原組成及其致敏蛋白P34免疫活性分析

稱取大豆分離蛋白50 mg置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液，渦旋混勻，超聲30 min（每間隔10 min渦旋混勻1次）后，10 000 r·min-1離心30 min，取上清液。通過Brad?ford法測定其蛋白質(zhì)含量后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫印跡（Western Blot）試驗，分析大豆蛋白分子組成及致敏蛋白P34的免疫活性。

1.2.1.1 大豆致敏蛋白P34含量的測定

利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，作用條件采用分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4.5%，交聯(lián)度為3.6%，進行垂直電泳，濃縮膠壓力設為100 V，分離膠壓力設為150 V，恒壓運行2 h。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)適當稀釋與溴酚藍上樣緩沖液按1∶1混合后制備成蛋白濃度為2 μg·μL-1上樣液，沸水浴煮沸5 min，冷卻后加樣量為10 μL，電泳完畢后，采用考馬斯亮藍R-250染色40 min，經(jīng)電泳脫色液脫色，待蛋白帶清晰后，利用Bio Rad ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)的Image LabTM軟件分析電泳譜帶。

1.2.1.2 大豆致敏蛋白P34免疫活性的分析研究

利用免疫印跡（Western Blot）法，通過觀察大豆蛋白致敏原P34在Western Blot圖譜中相應譜帶的顏色深淺變化和有無，分析其致敏性的強弱變化，具體操作如下：

①轉(zhuǎn)膜：將所測樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后將膠體從電泳槽卸下，并在電轉(zhuǎn)移液中馴染8～10 min，同時在濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的底板（陽極）上方，按無紡纖維墊→加厚濾紙→硝酸纖維素膜（NC膜）→馴染的膠體→加厚濾紙→無紡纖維墊→負極頂板的順序疊放，接通電源，恒流100 mV，轉(zhuǎn)寫3 h。

②NC膜的封閉：將轉(zhuǎn)寫后的NC膜，去離子水洗5 min后，放入含3%BSA的封閉液中室溫下封閉12 h。

③1次抗體的孵育：將封閉后的NC膜，用TBST漂洗3次，每次10 min，然后放入盛有F5（用含1%BSA稀釋液稀釋1 000倍濃度為2 μg·mL-1）1次抗體的密閉容器中，37℃下輕搖孵育2 h。

④2次抗體的孵育：回收一抗后，用TBST漂洗3次，每次10 min，將漂洗后的NC膜放入2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+ L）（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG（H+L）的孵育液中，37℃輕搖孵育2 h。

⑤顯色反應（大豆致敏蛋白P34的檢測）：回收二抗后將NC膜放入顯色液（25 mL辣根過氧化物酶底物溶液，450 μL 4-Chloro-1-Naphthol，15 μL 30%H2O2，充分混勻）中，充分反應20～25 min，大豆致敏蛋白P34譜帶即會顯色，待目標蛋白譜帶清晰出現(xiàn)后，將膜浸入1 mol NaCl溶液中，終止顯色反應，然后用去離子水反復沖洗2～3遍，置濾紙上干燥后，利用Bio Rad ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)的Image LabTM軟件分析電泳譜帶。

1.2.2 蛋白酶對大豆致敏蛋白P34酶解效果的篩選

選取7種蛋白酶用于試驗。采用福林酚法測定各種蛋白酶的酶活力。在相同酶活力條件下，根據(jù)蛋白酶對大豆致敏蛋白P34的水解能力進行選擇。將大豆蛋白配制成實際底物蛋白濃度為5%溶液，7種蛋白酶酶解條件見表1，以酶活與底物蛋白比為2 000 U·g-1加入相應的酶，將樣品置于水浴搖床中反應60 min后，100℃沸水浴15 min使酶失活，冷卻后采用SDS-PAGE法測定大豆致敏蛋白P34含量，茚三酮法測定大豆分離蛋白的水解度[9]。

表1 7種蛋白酶生產(chǎn)商推薦的最適反應條件和酶活力Table 1 Optimal reaction conditions of seven proteases and protease activity

1.2.3 蛋白酶反應條件的優(yōu)化

對優(yōu)選出的蛋白酶進行酶解條件優(yōu)化。以大豆致敏蛋白P34含量和大豆分離蛋白水解度為考查指標，對加酶量（100、300、500、1 000、1 500和2 000 U·g-1）、酶解時間（15、20、30、60、90和120 min）、pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5）、溫度（35、40、45、50、55和60℃），4個條件逐一進行優(yōu)化。

1.2.4 蛋白酶解物功能性測定

將大豆分離蛋白在優(yōu)化后的酶解條件下進行酶解，酶解后100℃沸水浴15 min使酶失活。將酶解液在14 000 r·min-1下均質(zhì)2 min，真空冷凍干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.1 溶解性的測定

溶解性以氮溶解指數(shù)（NSI）表示，分別稱取2.0 g大豆蛋白酶解物（大豆分離蛋白作對照），加入50 mL去離子水，配制成一定濃度的蛋白溶液，將蛋白溶液置30℃水浴加熱1 h后，取出以3 000 r·min-1離心20 min，將上清液進行凱氏定氮，求出水溶性氮含量。樣品中總氮含量采用凱氏定氮法測定，NSI的計算公式如下：

NSI（%）=水溶性氮/總氮×100%

1.2.4.2 粘度的測定

采用毛細管粘度計法測定：配制底物濃度為2.0%的大豆蛋白酶解物（大豆分離蛋白作對照）溶液，用NDJ-8S型粘度計測定其粘度。

1.2.4.3 吸油性的測定

[10]的方法，準確稱取3.0 g大豆蛋白酶解物（大豆分離蛋白作對照），加入大豆油9 mL，攪拌均勻后室溫放置30 min，使之充分吸油，然后離心（7 500 r·min-1，30 min），除去液體后，測定殘留物的重量，重復試驗3次，結(jié)果取平均值表示。

吸油率（g·g-1）=（離心后殘留物重-試樣干重）/試樣干重

1.2.4.4 保水性的測定

參照文獻[11]的方法，準確稱取5.0 g大豆蛋白酶解物（大豆分離蛋白作對照）加入50 mL去離子水，攪拌均勻后室溫放置30 min，然后離心（4 500 r·min-1，30 min）分離出上清液，測定殘留物質(zhì)量，同時測定上清液中的氮含量轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)質(zhì)量，重復試驗3次，結(jié)果取平均值表示。

保水率（g·g-1）=[離心后殘留物重-（試樣干重-上層清液中蛋白質(zhì)含量）]/（試樣干重-上層清液中蛋白質(zhì)含量）

1.2.4.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照文獻[12]的方法。蛋白乳化活性用EA表示，乳化穩(wěn)定性用ESI表示。配制濃度為0.75%大豆蛋白酶解物溶液（大豆分離蛋白作對照）15 mL，大豆油5 mL，高速乳化均質(zhì)機以一定速度均質(zhì)40 s，連續(xù)3次共計2 min，制成乳濁液后，立即用微量注射器從底部3個不同點分別抽取20 μL乳狀液放入3支試管中，再各加入5 mL 0.1%SDS混勻，用0.1%的SDS作為空白，在500 nm下記錄此時的吸光值E0，30 min后，同樣方法再抽取20 μL測定吸光度值Et。

計算公式如下：

1.2.4.6 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

蛋白的起泡性用FC表示，泡沫穩(wěn)定性用FS表示。測定方法為，取100 mL濃度為0.75%大豆蛋白酶解物溶液（大豆分離蛋白作對照），置于500 mL量筒中，使用高速乳化均質(zhì)機以一定速度均質(zhì)40 s，連續(xù)3次共計2 min，記錄均質(zhì)后頁面高度記為V0，靜置30 min后記錄頁面高度，記為Vt。計算公式如下：

起泡能力FC（%）=（V0-100）/100×100%

泡沫穩(wěn)定性FS（%）=（Vt-100）/（V0-100）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的分子組成及致敏蛋白P34免疫活性驗證結(jié)果

為明確國產(chǎn)大豆分離蛋白中大豆致敏蛋白組成及P34免疫活性，進行SDS-PAGE和Western-Blot試驗，結(jié)果見圖1。

圖1 大豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳與大豆致敏蛋白P34的Western Blot圖譜Fig.1 SDS-PAGE of soy protein isolate and Western Blot patterns of soyean protein P34

由圖1（a）可知，大豆分離蛋白電泳圖譜中亮度較高相關條帶分別為β-伴大豆球蛋白α′亞基，β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly Bd 60 k），β-伴大豆球蛋白β亞基，11S大豆球蛋白G1酸性鏈，G2堿性鏈，P34/Gly Bd 30k[13-18]。因此可知，國產(chǎn)大豆分離蛋白包含大豆致敏蛋白的全部組分。由圖1（b）可知，大豆致敏蛋白P34在Western Blot圖譜中有顏色較深的譜帶，因此說明其在大豆分離蛋白中依然存在致敏性，且活性很強。大豆蛋白致敏原P34在電泳圖中位置近于分子質(zhì)量為31 ku條帶處。

2.2 相同酶活力下酶對大豆致敏蛋白P34的降解能力的比較

各酶解物的SDS-PAGE電泳結(jié)果及水解度測定結(jié)果見圖2～3。

圖2 7種蛋白酶水解大豆分離蛋白的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of seven kinds of proteases hydrolysis results of SPI

圖3 7種蛋白酶水解大豆分離蛋白的水解度Fig.3 Hydrolysis results of seven kinds of proteases of SPI

由圖2可知，大豆分離蛋白經(jīng)7種蛋白酶持續(xù)水解60 min，在大豆致敏蛋白P34的特征譜帶處仍有部分殘留，但對于不同的酶其深淺度不一，說明其剩余含量不同，從而也說明七種蛋白酶對P34降解能力不同。相對而言風味蛋白酶和堿性蛋白酶的P34特征譜帶顏色較淡，說明其含量相對較少，進而說明這兩種酶對P34的降解能力相對較強，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的降解效果次之，復合蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶對大豆分離蛋白水解的能力較弱，P34含量較高。7種蛋白酶對致敏蛋白P34的水解效果不同，這可能是由于酶對蛋白的作用位點不同所致。

由圖3可知，相同的酶活力下，風味蛋白酶和堿性蛋白酶的水解度最大，其次是木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶，而胰蛋白酶的水解度最小。

綜合以上分析，風味蛋白酶和堿性蛋白酶對大豆分離蛋白中致敏蛋白P34的降解效果最好且水解度也最大，因此選擇風味蛋白酶和堿性蛋白酶進行后續(xù)研究，優(yōu)化酶解條件。

2.3 風味蛋白酶酶解條件優(yōu)化

2.3.1 電泳圖譜研究

利用酶解前后的電泳圖譜優(yōu)化風味蛋白酶水解條件，結(jié)果見圖4。

圖4（a）為加酶量對酶解效果的影響（1～6加酶量分別為100、300、500、1 000、1 500和2 000 U·g-1；其他反應條件：反應時間60 min，pH 7.0，溫度50℃）。由圖4（a）可知，隨著加酶量的增加，大豆致敏蛋白P34水解越完全，當加酶量為2 000 U·g-1時，經(jīng)過60 min持續(xù)水解，大豆致敏蛋白P34的相應譜帶已經(jīng)完全消失，因此確定適宜的加酶量為2 000 U·g-1。圖4（b）為反應時間對酶解效果的影響（1～6反應時間分別為15、20、30、60、90和120 min；其他反應條件：加酶量2 000 U·g-1，pH 7.0，溫度50℃）。由圖4（b）可知，隨著酶解時間的增加，大豆致敏蛋白P34被逐漸水解，作用時間＞60 min時，電泳圖譜中大豆致敏蛋白P34相應條帶已完全消失，而作用時間120 min時，大部分蛋白完全被水解，只剩下分子量在20 ku的小分子蛋白質(zhì)。最終確定最佳的酶解時間為60 min。圖4（c）為pH對酶解效果的影響（1～6 pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5；其他反應條件：加酶量2 000 U·g-1，時間60 min，溫度50℃）。由圖4（c）可知，pH在6.5時水解效果最好，而pH在6.0、7.0、7.5、8.0、8.5時，大豆致敏蛋白P34水解不徹底，因此最佳的pH為6.5。圖4（d）為反應溫度對酶解效果的影響（1～6反應溫度分別為35、40、45、50、55和60℃；其他反應條件：加酶量2 000 U·g-1，時間60 min，pH 6.5）。由圖4（d）可知，各溫度條件下，大豆致敏蛋白P34均有不同程度水解，其中反應溫度在55℃時，P34水解效果最好，所以確定最佳酶解溫度為55℃。

圖4 風味蛋白酶水解條件優(yōu)化SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of optimization of flavourzyme hydrolysis conditions

2.3.2 水解度對比研究

通過不同水解條件下水解度的變化，研究風味蛋白酶酶解大豆致敏蛋白P34的程度與水解度的關系，結(jié)果見圖5。

圖5 風味蛋白酶水解條件對水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis results of flavourzyme hydrolysis conditions

由圖5可知，隨著加酶量的增加，水解度也逐漸增大，當加酶量為2 000 U·g-1時，蛋白質(zhì)水解度達到最大；當酶解時間逐漸增加時，水解度也呈逐漸增大趨勢，而當酶解時間達到120 min時水解度達到最大；當pH 6.0～6.5時，水解度不斷增加，而當pH增加到7時，蛋白質(zhì)水解度呈下降趨勢，繼續(xù)增大pH 8.5，水解度無明顯變化。當溫度從35℃增加到55℃時，水解度逐漸增加，在55℃時達到最大，溫度繼續(xù)增加到60℃時，水解度隨溫度升高而降低。

綜合以上分析，電泳的分析結(jié)果與水解度的分析結(jié)果一致，水解度越高大豆致敏蛋白P34水解越完全，消除越徹底。因此，確定最佳的風味蛋白酶反應條件為加酶量2 000 U·g-1、反應時間60 min、pH為6.5、溫度55℃。

2.4 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

2.4.1 電泳圖譜研究

利用酶解前后的電泳圖譜優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件，結(jié)果見圖6。

圖6（a）為加酶量對酶解效果的影響（1～6加酶量分別為100、300、500、1 000、1 500和2 000 U·g-1；其他反應條件：反應時間60 min，pH 8.0，溫度55℃）。由圖6（a）可知，隨著加酶量的增加，大豆致敏蛋白P34不斷被水解，當加酶量為1 500和2 000 U·g-1時，大豆致敏蛋白P34的條帶已經(jīng)完全消失，說明已經(jīng)被完全水解。從節(jié)約試驗成本方面考慮確定最終加酶量為1 500 U·g-1。圖6（b）為反應時間對酶解效果的影響（1～6反應時間分別為15、20、30、60、90和120 min；其他反應條件：加酶量1 500 U·g-1，pH 8.0，溫度55℃）。由圖（b）可知，隨著反應時間的延長，大豆致敏蛋白P34不斷被水解，當水解時間為60、90和120 min時，大豆致敏蛋白P34在電泳圖譜中的特征譜帶完全消失，說明P34已經(jīng)被完全水解，從提高試驗效率方面考慮，選擇最終的水解時間為60 min。圖6（c）為pH對酶解效果的影響（1～6 pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；其他反應條件：加酶量1 500 U·g-1，反應時間60 min，溫度55℃）。由圖（c）可知，堿性蛋白酶在試驗設定的不同pH下都能將大豆致敏蛋白P34水解掉，因堿性蛋白酶的最適pH為8.0，所以確定最終pH 8.0。圖6（d）為反應溫度對酶解效果的影響（1～6反應溫度分別為35、40、45、50、55和60℃；其他反應條件：加酶量1 500 U·g-1，時間6 min，pH 8.0）。由圖（d）可知，溫度對堿性蛋白酶水解大豆致敏蛋白P34的影響不明顯，在試驗設定的各溫度下，堿性蛋白酶均能將大豆致敏蛋白P34完全水解，考慮到堿性蛋白酶的最適溫度為55℃，所以最終確定堿性蛋白酶的最佳溫度條件為在55℃。

圖6 堿性蛋白酶水解條件優(yōu)化SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of optimization of alcalase hydrolysis conditions

2.4.2 水解度對比研究

通過不同水解條件下水解度的變化，研究堿性蛋白酶水解大豆致敏蛋白P34的程度與水解度的關系，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增大，當加酶量為1 500 U·g-1時，水解度達到最大，繼續(xù)增大加酶量時，蛋白質(zhì)水解度保持不變；隨著酶解時間的延長，水解度也逐漸增大，在60 min時達最大，之后隨時間延長，水解度保持不變。當pH從6.0到8.5時，水解度不斷增加，在pH 8.0達最大，而當pH增加到8.5時，蛋白質(zhì)水解度保持不變。當溫度從35℃增加到60℃時，水解度逐漸增加，在50℃時達到最大，溫度繼續(xù)增加到55℃時水解度隨溫度升高而降低，當溫度增加到60℃水解度保持不變。

綜合以上分析，電泳分析結(jié)果與水解度分析結(jié)果基本一致，大豆致敏蛋白P34完全水解時，水解度基本達到最大值。因此，確定最佳的堿性蛋白酶反應條件為加酶量1 500 U·g-1、反應時間60 min、pH 8.0、溫度55℃。

圖7 堿性蛋白酶水解條件對水解度影響Fig.7 Effect of of hydrolysis results of alcalase hydrolysis conditions

2.5 最優(yōu)酶解條件下P34免疫學活性驗證研究

為驗證最優(yōu)酶解條件下可使大豆致敏蛋白P34免疫活性喪失，進行免疫印跡實驗，結(jié)果見圖8。由圖8可知，未優(yōu)化酶解條件下7種蛋白酶的免疫印跡圖譜中都有不同程度亮度譜帶，而在最優(yōu)酶解條件下風味蛋白酶和堿性蛋白酶P34譜帶消失，說明在最優(yōu)酶解條件下大豆致敏蛋白P34的免疫活性完全喪失。

圖8 不同蛋白酶酶解條件下產(chǎn)物的Western Blot圖譜Fig.8 Western Blot patterns of enzymatic hydrolysate ofoteases hydrolysis conditions

2.6 最優(yōu)條件下蛋白酶解物的功能特性

對最優(yōu)條件下大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的功能特性研究結(jié)果見表2。

表2 大豆蛋白酶解物功能性比較Table 2 Changes of physicochemical properties of enzymatic hydrolysate

由表2中可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物的溶解性都有較大幅度提高，其中風味蛋白酶解物NSI值由原來大豆分離蛋白的65.5%，提高到80.5%，而堿性蛋白酶解物NSI值提高到79.0%。蛋白酶解物溶解性提高的原因可能是大豆分離蛋白酶解后，斷裂成多肽和小分子物質(zhì)，使-NH2和-COOH的數(shù)目增多，極性增加，電荷密度增大，親水性增強，提高溶解性。

由表2中可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物粘度都有較大幅度降低，其中風味蛋白酶解物黏度由原來大豆分離蛋白6.85（mPa·s），降低到1.12（mPa·s），而堿性蛋白酶解物的黏性降低到1.09（mPa·s）。蛋白酶解物黏性降低原因可能是大豆分離蛋白經(jīng)蛋白酶酶解產(chǎn)生許多小分子肽類，使原來的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，膨脹率降低，由于蛋白多聚體的解離和離子基團的增加，增強蛋白質(zhì)分子有序性，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的表觀體積減小，使粘度下降。

由表2可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物的吸油性略有降低，其中風味蛋白酶解物的吸油率由原來大豆分離蛋白酶的0.99（g·g-1），降低到0.92（g·g-1），而堿性蛋白酶解物的吸油率降低到0.90（g·g-1）。蛋白的吸油性是因為油與疏水性基團結(jié)合，將油包裹在蛋白中，蛋白酶解物吸油性降低的原因是蛋白酶水解大豆分離蛋白后，由于水解度增大，肽鏈變小，使形成包裹油的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞，吸油性降低。

由表2可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物保水性都有較大幅度提高，其中風味蛋白酶解物保水率由原來大豆分離蛋白的5.98（g·g-1）提高到6.12（g·g-1），而堿性蛋白酶解物的保水率提高到6.25（g·g-1）。蛋白酶解物保水性提高原因是大豆分離蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，使大量的親水基團外露，保水性有所提高。

由表2可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性都有較大幅度提高，其中風味蛋白酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性由原來大豆分離蛋白的0.49（OD500值）和12（min）提高到0.68（OD500值）和30（min），而堿性蛋白酶解物乳化性和乳化穩(wěn)定性提高到0.61（OD500值）和27（min）。蛋白酶解物乳化性和乳化穩(wěn)定性提高的原因是大豆分離蛋白經(jīng)蛋白酶水解，產(chǎn)生許多肽段，致使大量疏水基團暴露，大量肽分子進入油水界面，降低界面張力，由于疏水基向里親水基向外包裹在油表面，起到保護作用，由于-COO-所帶電荷，通過靜電排斥作用阻止油滴間聚和，因此提高乳化活性。由于蛋白質(zhì)疏水性越大，界面上吸附蛋白質(zhì)濃度越大，界面張力越小，乳狀液更穩(wěn)定。

由表2可知，風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物的起泡性都有較大幅度提高，而泡沫穩(wěn)定性都有較大幅度降低，其中風味蛋白酶解物起泡性由原來大豆分離蛋白的80.5%提高到85.2%，泡沫穩(wěn)定性由原來大豆分離蛋白的71.5%降低到65.0%，而堿性蛋白酶的起泡性提高到83.5%，泡沫穩(wěn)定性降低到61.5%。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是由于產(chǎn)生泡沫需要蛋白質(zhì)分子間的肽鏈展開，在液面上通過各種相互作用形成一種韌膜，而大豆分離蛋白經(jīng)酶解后其溶解性的增強致使蛋白質(zhì)擴散并吸附在空氣/水界面的能力增強，降低界面張力，提高發(fā)泡能力。但是酶解后蛋白質(zhì)的粘度會變小，液膜會變得很脆弱無法裹住氣泡，使泡沫穩(wěn)定性變差。

綜合以上分析，兩種蛋白酶解物的溶解性、保水性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性，起泡性明顯好于大豆分離蛋白，而粘性、吸油性和泡沫穩(wěn)定性低于大豆分離蛋白，由于蛋白的粘度、吸油性和泡沫穩(wěn)定性都與濃度和pH、溫度等因素有關，可通過后期調(diào)節(jié)其他因素使其發(fā)揮更好效果。相比較而言，堿性蛋白酶解物的保水性好于風味蛋白酶解物，而其他性質(zhì)略差于風味蛋白酶解物，這可能是由于堿性蛋白酶和風味蛋白酶的作用位點不同，以至酶解物中小分子蛋白種類不同所致。

3 結(jié)論

不同來源酶由于其酶切位點不同，對大豆致敏蛋白P34呈現(xiàn)出不同失活作用效果。在相同酶活力下風味蛋白酶和堿性蛋白酶對大豆致敏蛋白P34水解能力較強，在最優(yōu)水解參數(shù)下能完全去除其免疫活性。經(jīng)最優(yōu)條件下獲得風味蛋白酶解物和堿性蛋白酶解物功能特性，如溶解性、保水性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性和起泡性，明顯優(yōu)于原料大豆分離蛋白，而其中風味蛋白酶解物的功能特性要好于堿性蛋白酶解物。

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Effect of enzymatic hydrolysis process on allergenic activity of soy?bean protein P34 and physicochemical properties of enzymatic hydro?lysate/

ZHENG Huanyu1,2,BAI Xiaojuan1,ZHANG Lili1,DONG Xiaochao2,XU Hui2,HAN Jianchun1,2, ZHU Xiuqing1,2(1.School of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Soybean Technology Development and Research Center of Heilongjiang Province,Harbin 150030,China)

Soybean protein was hydrolyzed with seven different kinds of proteases,respectively.The elimination effect of soy protein P34 was analyzed by determination of SDS-PAGE and hydrolysis degree, and the immune activity of P34 before and after hydrolysis was determined by Western Blot.The results showed that the P34 content in soybean degraded to varying degrees after hydrolyzed with different proteases and the flavor and alkaline proteases were two most effective proteases that could completely eliminate P34.Under optimal conditions,the solubility,water-retaining property,emulsification,emulsion stability and foaming ability of enzymatic hydrolysis product which hydrolyzed with flavors or alkaline protease increased significantly,whereas the viscosity,oil absorbency and foam stability of it reduced.

soybean;soybean allergen P34;enzymatic hydrolysis;functionality

TS214.2

A

1005-9369（2014）06-0006-10

時間 2014-6-11 16:05:46 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1605.003.html

鄭環(huán)宇,白小娟,張麗麗,等.酶水解對大豆致敏蛋白P34免疫活性的影響及酶解產(chǎn)物理化性質(zhì)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2014,45(6):6-15.

Zheng Huanyu,Bai Xiaojuan,Zhang Lili,et al.Effect of enzymatic hydrolysis process on the allergenic activity of soybean protein P34 and the physicochemical properties of enzymatic hydrolysate[J].Journal of Northeast Agricultural University, 2014,45(6):6-15.(in Chinese with English abstract)

2013-12-31

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2013AA102208）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B04）；黑龍江省教育廳新世紀優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目（1154-NCET-003）

鄭環(huán)宇（1975-），女，副研究員，博士，碩士生導師，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:841625891@qq.com