TEAD1在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)研究

倪華，賁文銳，李文萍，李瑞婷，靳方圓

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

TEAD1在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)研究

倪華，賁文銳，李文萍，李瑞婷，靳方圓

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

采用Real-time PCR和原位雜交檢測TEAD1在圍著床期小鼠子宮及人工誘導(dǎo)蛻膜化組織中的表達(dá)情況。Real-time PCR結(jié)果顯示，在妊娠1～8 d的小鼠子宮中，TEAD1 mRNA的表達(dá)隨妊娠天數(shù)的增加逐漸增強(qiáng)；原位雜交結(jié)果顯示，TEAD1 mRNA強(qiáng)表達(dá)于5～8 d小鼠子宮蛻膜細(xì)胞及胚胎上，TEAD1 mRNA強(qiáng)表達(dá)于人工誘導(dǎo)蛻膜化組織中。推測TEAD1參與調(diào)節(jié)子宮基質(zhì)蛻膜化過程，在胚胎著床過程發(fā)揮重要作用。

TEAD1；胚胎著床；蛻膜化；小鼠

胚胎著床是指活化胚泡與處于接受態(tài)子宮相互作用，導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜建立緊密聯(lián)系過程，此過程中子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行增殖分化與凋亡，其中基質(zhì)細(xì)胞分化成蛻膜細(xì)胞為胚胎正常著床提供空間[1-2]。

TEA結(jié)構(gòu)域家族（TEA domain family）是一類具有TEA/ATTS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子[3]，TEAD（TEA/ ATTS domain）最初被確定為一種有能力結(jié)合SV40增強(qiáng)子并激活其轉(zhuǎn)錄的核蛋白質(zhì)[4]，在哺乳動(dòng)物中有4個(gè)基因編碼4個(gè)同源TEAD家族成員，被命名為TEAD1～4，每個(gè)基因擁有不同的但不相互排斥的表達(dá)模式[5]。TEAD1～4從植入前胚胎到成年組織廣泛表達(dá)，調(diào)節(jié)骨骼和心肌的發(fā)育、骨骼肌的再生、神經(jīng)嵴發(fā)育等過程[6]。其中TEAD1能夠促進(jìn)心肌特異性基因的表達(dá)，TEAD1突變小鼠因遭受嚴(yán)重的心臟缺陷而胚胎致死[5]，TEAD1也參與調(diào)節(jié)小鼠成肌細(xì)胞系C2C12的分化過程[7]，Landin等研究表明，TEADs蛋白參與細(xì)胞增殖和凋亡途徑[8]，推測TEADs在小鼠胚胎著床中起重要作用。目前，TEADs在小鼠子宮中研究未見報(bào)道，本研究采用Real-time PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)分析TEAD1 mRNA在早期妊娠小鼠子宮中表達(dá)規(guī)律，探討其在小鼠胚胎著床過程中的作用，為進(jìn)一步探索TEADs胚胎著床分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

TRIzol reagent、PGEM-T Vector System I載體購于Promega公司；Taq DNA聚合酶購于北京天根生化科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit購于TaKaRa公司；Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）購于Thermo公司；DIG RNA Label?ing Kit（SP6，T7）、抗地高辛抗體購于Roche公司；引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成；熒光定量PCR儀為ABI PRISM 7300。

1.2 動(dòng)物

健康成年昆明白近交系雌雄小鼠，6～10周齡，性成熟，體重為20～30 g。自由飲食和飲水，正常光照，室溫22℃。

1.3 動(dòng)物模型及取材

1.3.1 早期妊娠

每天15:00～16:00，挑選自然發(fā)情的成年雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠，在次日上午9:00前檢查陰道栓，有栓者當(dāng)天定為妊娠第1天，分別在各試驗(yàn)日上午9:00收集妊娠第1～8天的小鼠子宮，液氮速凍后-80℃冰箱中凍存待用。

1.3.2 人工誘導(dǎo)蛻膜化

于上午9:00，取假孕第4天的雌鼠，向其一側(cè)子宮角中注射25～50 mL芝麻油，以誘導(dǎo)小鼠子宮發(fā)生蛻膜化反應(yīng)；另一側(cè)子宮角不注射芝麻油，作為陰性對照。假孕第8天，處死小鼠，取子宮，通過觀察形態(tài)變化及稱重確定是否發(fā)生蛻膜化，分別收集人工誘導(dǎo)蛻膜化的子宮角及其陰性對照側(cè)子宮角，取材方法與早期妊娠模型取材方法相同。

1.4 方法

1.4.1 Real-time PCR

常規(guī)Trizol法提取各組小鼠子宮內(nèi)膜總RNA，在紫外分光光度計(jì)上檢測度，OD260/OD280比值為1.8～2.0，可用于后續(xù)試驗(yàn)，各組RNA保存于-80℃冰箱備用。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成TEAD1的cDNA鏈保存在-20℃冰箱中備用。

參照GenBank設(shè)計(jì)TEAD1（NM_001166584.1）和GAPDH（NM_008084.2）跨內(nèi)含子引物引物序列，TEAD1的sense:5′CGCCTTCTTCCTCGTCAA 3′，antisense:5′TCGCATACTCCGTCTCTAC 3′；GAP?DH sense:5′TCTCCTGCGACTTCAACA 3′，anti?sense:5′TGTAGCCGTATTCATTGTCA 3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸60 s，40次循環(huán)。

1.4.2 原位雜交

參照GenBank設(shè)計(jì)TEAD1序列（NM_001166 584.1），設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引sense 5′CCATCCAGC?CAGCAGTCACA 3′，antisense:5′GAACCTCGCATA CTCCGTCTCTAC 3′，PCR反應(yīng)后，回收產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒由上海生工測序，用SP6/T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄正義、反義地高辛標(biāo)記的RNA探針，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

將妊娠1～8 d及人工誘導(dǎo)蛻膜化的小鼠子宮制成冰凍切片，原位雜交方法見參考文獻(xiàn)[9]。原位雜交時(shí)取出切片，經(jīng)4%多聚甲醛固定、1% Triton-X100透膜、預(yù)雜交液（5XSSC，50%去離子甲酰胺）預(yù)雜交15 min、滴雜交液（5XSSC，50%去離子甲酰胺，0.02%BSA，0.25 mg·mL-1tRNA，10%硫酸葡聚糖，200～500 ng·mL-1的探針）雜交過夜、SSC梯度洗滌、1%Blocking Solution封閉、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體孵育過夜、滴加NBT/BCIP顯色，出現(xiàn)棕褐色陽性信號時(shí)停止顯色，甲基綠對染后拍照。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)時(shí)定量所得各組CT值經(jīng)過2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Real-time PCR結(jié)果

Real-time PCR所得各組CT值經(jīng)過2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量，并用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)值以表示（見表1）。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示TEAD1 mRNA在妊娠小鼠D1、D2、D4、D5非著床位點(diǎn)（D5NI）、D5著床位點(diǎn)（D5I）和D8子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，表達(dá)量隨妊娠天數(shù)增加而增強(qiáng)，其中除D4與D5NI無顯著差異外，各組之間比較均有顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D5NI顯著低于D5I，D8顯著高于其他組（見圖1）。

表1 TEAD1 mRNA在小鼠早期妊娠子宮中的相對表達(dá)及方差分析Table 1 Relative expression and analysis of variance of TEAD1 mRNA in pregnant mice uterus

圖1 TEAD1 mRNA在早期妊娠小鼠子宮中的表達(dá)Fig.1 Expression of TEAD1 mRNA in mouse uterus during early pregnancy

2.2 探針制備

2.2.1 擴(kuò)增片段測序結(jié)果分析

含有重組質(zhì)粒的菌液交由上海生工測序，用DNAMAN 6.0軟件對測序結(jié)果與目的基因全序列擬進(jìn)行比對分析。TEAD1擴(kuò)增片段與已知的TEAD1 mRNA序列的相似比為100%，表明插入片段為TEAD1片段。

2.2.2 插入方向鑒定

目的基因克隆片段在連接到pGEM-T質(zhì)粒載體過程中方向隨機(jī)。采用上游引物、下游引物、T7引物和SP6引物，其中兩種引物任意配對組成6種引物組合，使用PCR方法快速鑒定克隆質(zhì)粒。將克隆片段的正義鏈插入載體中T7序列下游，反義鏈插入SP6序列下游，定義為正向插入，則電泳時(shí)對應(yīng)于上游引物-SP6、下游引物-T7將擴(kuò)增有條帶；反之定義為反向插入。PCR結(jié)果顯示上游引物-T7、下游引物-SP6出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，表明TEAD1的克隆片段成功插入pGEM-T載體且為反向插入（見圖2）。選用T7聚合酶制備反義cRNA探針，SP6聚合酶制備正義探針。

圖2 TEAD1擴(kuò)增片段插入方向的鑒定Fig.2 Identification of the inserting direction of TEAD1 cDNA fragments

2.3 人工誘導(dǎo)蛻膜化組織的鑒定

假孕第8天上午9:00，將一側(cè)子宮角注油的小鼠處死，取出子宮，觀察其形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注油一側(cè)子宮膨脹變粗，而未注油一側(cè)未發(fā)生變化，證明小鼠子宮人工誘導(dǎo)蛻膜化成功（見圖3）。

圖3 人工誘導(dǎo)蛻膜化子宮Fig.3 Uterus of artificial decidualization

2.4 TEAD1 mRNA在子宮中表達(dá)的分析

TEAD1 mRNA在早期妊娠小鼠子宮中表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果見表2，將信號強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)表達(dá)（+++）4個(gè)等級，定位結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，在妊娠D1～D4及D5非著床位點(diǎn)，均未檢測到TEAD1 mRNA陽性信號。在D5著床位點(diǎn)圍繞胚胎周圍的蛻膜細(xì)胞檢測到明顯的TEAD1 mRNA陽性信號，D6～D8子宮中TEAD1 RNA出現(xiàn)在蛻膜細(xì)胞區(qū)，隨著妊娠進(jìn)行，強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)趨勢。TEAD1 mRNA也強(qiáng)表達(dá)人工誘導(dǎo)蛻膜化組織中，而在蛻膜對照子宮中未檢測到陽性信號。

表2 TEAD1 mRNA在早期妊娠小鼠子宮中的表達(dá)Table 2 Expression of TEAD1 mRNA in mouse uterus during early pregnancy

圖4 原位雜交檢測TEAD1 mRNA在小鼠早期妊娠子宮及人工誘導(dǎo)蛻膜子宮中的表達(dá)情況Fig.4 In situ hybridization was used to detect the expresstion of TEAD1 mRNA in uterus of the early pregnant and artificial decidualization mouse

3 討論與結(jié)論

TEAD蛋白是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎發(fā)育和各種組織分化過程[8]，也參與多種癌癥發(fā)生過程[10-13]。TEADs發(fā)揮基因調(diào)控作用需要額外因子或輔激活物[14]，這些因子大體上分為YAP及其同源物TAZ；Vgll蛋白；p160核受體輔激活物家族[5]，其中研究最多的為YAP。在MCF10A細(xì)胞中YAP過表達(dá)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[15]，在多種人類癌癥組織也檢測到高YAP蛋白水平[16]，是腫瘤發(fā)生標(biāo)志。YAP自身沒有DNA結(jié)合活性，需通過與TEAD結(jié)合，共同配合調(diào)控基因表達(dá)[5]，TEAD需要YAP誘導(dǎo)的基因表達(dá)、細(xì)胞生長、錨定非依賴性生長和EMT[17]。研究表明，TEADs與YAP/TAZ結(jié)合可上調(diào)CTGF（Connective tissue growth factor）、Cyr61、受體酪氨酸激酶Axl、Ki67、c-myc和sur?vivin，促進(jìn)癌癥發(fā)展[17-19]?？芍琓EAD與YAP在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。胚胎著床過程中，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生廣泛的增殖分化為蛻膜細(xì)胞，蛻膜細(xì)胞常有雙核或多倍體狀態(tài)[20]。癌細(xì)胞在增殖過程中也可出現(xiàn)巨核、雙核或多核現(xiàn)象，與蛻膜細(xì)胞相似。鑒于TEADs在癌細(xì)胞增殖中的作用，推測TEAD1在蛻膜細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用。

原位雜交結(jié)果顯示，在小鼠妊娠1～4 d及第5天非著床位點(diǎn)子宮檢測不到TEAD1 mRNA表達(dá)，提示TEAD1可能對著床時(shí)子宮接受態(tài)調(diào)節(jié)不起作用，而在妊娠第5天著床位點(diǎn)處的胚胎周圍的蛻膜區(qū)域開始檢測到TEAD1 mRNA陽性信號，妊娠6～8 d，子宮中TEAD1 mRNA的表達(dá)范圍從圍繞胚胎的蛻膜區(qū)域逐漸擴(kuò)展到整個(gè)蛻膜區(qū)，強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢與Real-time PCR結(jié)果一致，推測TEAD1可能由YAP激活轉(zhuǎn)錄出TEAD1，TEAD1-YAP共同調(diào)控與蛻膜化相關(guān)基因表達(dá)，參與小鼠子宮蛻膜化過程，TEAD1 mRNA也強(qiáng)表達(dá)于人工誘導(dǎo)蛻膜化組織中，進(jìn)一步加強(qiáng)對TEAD1功能推測證據(jù)。

本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)TEAD1 mRNA在妊娠小鼠子宮蛻膜細(xì)胞中高表達(dá)。Hong等研究表明，YAP/ TAZ與TEAD共同組成Hippo通路主要效應(yīng)器[21]，當(dāng)Hippo通路激活時(shí)，其核心組成部分Lats1/2激酶直接磷酸化YAP使其失活[22]，限制細(xì)胞過度增殖，Hippo通路通過抑制細(xì)胞的增殖與促進(jìn)凋亡限制控制器官大小[23-24]，因此Hippo通路是否在蛻膜化過程發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果顯示，TEAD1在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜呈時(shí)空特異性表達(dá)，且在人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中強(qiáng)表達(dá)，提示TEAD1可能參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程，但TEAD1是否與TAP/TAZ配對激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是否通過Hippo通路促進(jìn)蛻膜細(xì)胞的凋亡需深入研究。

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Expression of TEAD1 in endometrium of mice during peri-implantationperiod/

NI Hua,BEN Wenrui,LI Wenping,LI Ruiting,JIN Fangyuan(School of Life Science,NortheastAgricultural University,Harbin,150030,China)

Real-time PCR andin situhybridization were used to detect the expresstion of TEAD1 in peri-implantation uterus of mice and in artificial decidual cells.Real-time PCR results showed that the expression level of TEAD1 mRNA was gradually increased in pregnant mice 1-8 d uterus;in situ hybridization showed that,TEAD1 strongly expressed in uterine decidual cells and embryos from pregnant 5-8 d and artificial decidual cells.Inferred TEAD1 might be involved in regulating uterine stromal decidualization and play an important role in embryo implantation process.

TEAD1;embryo implantation;decidualization;mice

Q26

A

1005-9369（2014）06-0097-06

時(shí)間 2014-6-11 16:12:46 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1612.011.html

倪華,賁文銳,李文萍,等.TEAD1在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):97-102.

Ni Hua,Ben Wenrui,Li Wenping,et al.Expression of TEAD1 in endometrium of mice during peri-implantation period[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):97-102.(in Chinese with English abstract)

2012-10-24

國家自然科學(xué)基金（30500361）

倪華（1973），女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榕咛ブ才c卵泡發(fā)育。E-mail:huani@neau.edu.cn