乳酸菌體外降解膽固醇的影響因素研究

任大勇, 翁璐超, 劉宏鋒, 周亭亭, 張振業(yè), 邵麗芳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062)

乳酸菌體外降解膽固醇的影響因素研究

任大勇1, 翁璐超1, 劉宏鋒2, 周亭亭1, 張振業(yè)1, 邵麗芳1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;
2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062)

研究了影響乳酸菌體外降解膽固醇的4個(gè)因素:膽鹽質(zhì)量濃度、膽固醇質(zhì)量濃度、培養(yǎng)基初始pH值和菌體培養(yǎng)時(shí)間.結(jié)果表明,受試菌株的降解能力顯著受上述因素的影響;在相同條件下,不同菌株的降解能力差異顯著.總體上,膽鹽質(zhì)量濃度為4～6mg/mL,膽固醇質(zhì)量濃度為190～230mg/L,培養(yǎng)基初始pH值在5～7,菌體培養(yǎng)時(shí)間11～23 h時(shí),乳酸菌降解膽固醇的能力最高,達(dá)到50%以上.

乳酸菌;膽固醇;影響因素;體外

膽固醇與心腦血管疾病、高血脂等疾病的發(fā)作有密切的關(guān)系.臨床研究表明,總膽固醇水平每升高1mmol/L,冠心病死亡的概率就會(huì)增加35%[1].近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的大量研究表明,乳酸菌對(duì)膽固醇具有較強(qiáng)的降解作用,適量長(zhǎng)期飲用乳酸菌發(fā)酵的乳制品具有降低血清膽固醇含量的作用.目前,研究人員開(kāi)展了一系列乳酸菌降低膽固醇的實(shí)驗(yàn),目的在于篩選優(yōu)良菌株,開(kāi)發(fā)功能性乳酸菌制品[2-3].研究表明,很多因素都可以影響乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力,例如膽固醇濃度、膽鹽濃度、培養(yǎng)基的初始的pH值、乳酸菌培養(yǎng)時(shí)間等[4].本文對(duì)不同乳酸菌菌株在不同的培養(yǎng)條件下體外降解膽固醇能力的影響做了研究,旨在明確乳酸菌發(fā)揮降膽固醇作用的最佳條件,為科學(xué)使用益生菌提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌種

實(shí)驗(yàn)選取6種乳酸菌:發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、糞腸球菌、德氏乳桿菌乳酸亞種、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,均為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MRS培養(yǎng)基,青島海博生物公司;牛膽鹽,中國(guó)惠世有限公司;膽固醇,北京鼎國(guó)有限公司;硫代乙醇酸鈉、正己烷、二甲亞砜、95%乙醇、氫氧化鉀、硫酸、鄰苯二甲醛均為分析純.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

DHP-781型恒溫培養(yǎng)箱,湖北醫(yī)療器械廠; 722E型分光光度計(jì),上海光譜儀器公司;QL866型漩渦震蕩混合器,江蘇其林貝爾有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái),上海新苗有限公司;DK-S28型水浴鍋,上海精宏有限公司.

1.2 膽固醇質(zhì)量濃度測(cè)定方法

膽固醇質(zhì)量濃度測(cè)定方法按文獻(xiàn)進(jìn)行[5-6],并作適當(dāng)修改.取0.5 m L培養(yǎng)24 h后的乳酸菌上清液于試管中,加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇3 mL、0.5mol/L KOH溶液2mL,漩渦震蕩1min后,置于60℃水浴鍋中皂化10min后取出試管迅速冷卻.冷卻完全后加入5 mL正己烷,漩渦震蕩1 min進(jìn)行萃取,萃取完全后取上層液體于另一干燥潔凈的試管中,靜置10min后加入3 mL水,漩渦振蕩1 min后靜置10 min,待分層后取2.5 mL上層溶液于試管中,置于80℃水浴鍋中加熱揮發(fā)至無(wú)液體殘留,取出試管加引用格式:任大勇,翁璐超,劉宏鋒,等.乳酸菌體外降解膽固醇的影響因素研究.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2014,32(5):41-45.

REN Dayong,WENG Luchao,LIU Hongfeng,et al.Factors influencing in vitro cholesterol removal ability of lactic acid

bacteria.Journal of Food Science and Technology,2014,32(5):41-45. 4 mL鄰苯二甲醛顯色劑,漩渦振蕩1 min后靜置10 min,加入2 mL硫酸漩渦振蕩1 min,避光靜置10 min后,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度,根據(jù)膽固醇與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算膽固醇的質(zhì)量濃度.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在干燥潔凈的5支試管中分別加入5 mL含膽鹽質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基,分別再加入0.05,0.10,0.15,0.2,0.25 mL的膽固醇母液使膽固醇質(zhì)量濃度為20,40,60,80,100mg/L,依照測(cè)定膽固醇的方法測(cè)定其吸光度,橫坐標(biāo)為膽固醇質(zhì)量濃度,縱坐標(biāo)為吸光度繪制曲線,可得到曲線回歸方程,計(jì)算膽固醇的質(zhì)量濃度.膽固醇的去除率按式(1)計(jì)算[7].

膽固醇去除率/%=(1-ρ1/ρ0)×100, (1) 式(1)中,ρ1為培養(yǎng)后菌液中上清液中的膽固醇質(zhì)量濃度;ρ0為初始培養(yǎng)基中總膽固醇的質(zhì)量濃度.

1.4 膽鹽質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的研究

分別加入5 mL含有170 mg/L膽固醇(5 mL MRS-THIO培養(yǎng)基加入425μL母液)的MRS-THIO培養(yǎng)基于6支干燥潔凈的試管,添加膽鹽分別至質(zhì)量濃度為0,2,4,6,8,10mg/mL,接種量按體積比的3%的量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測(cè)定方法測(cè)定其剩余的膽固醇質(zhì)量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對(duì)照.

1.5 膽固醇質(zhì)量濃度降膽固醇能力的研究

分別加膽鹽質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的MRSTHIO培養(yǎng)基5 m L于6支干燥潔凈的試管,再分別加入膽固醇母液75,175,275,375,475,575μL至膽固醇質(zhì)量濃度為30,70,110,150,190,230mg/L,接種量按體積比的3%的量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測(cè)定方法測(cè)定其剩余的膽固醇質(zhì)量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對(duì)照.

1.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的研究

取7支干燥潔凈的試管,分別加含有170 mg/L膽固醇的膽鹽質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基5 mL,每種菌按3%的接種量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)3,7, 11,15,19,23,36 h.取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測(cè)定方法測(cè)定其剩余的膽固醇質(zhì)量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對(duì)照.

另取36支試管各加入1 m L膽鹽質(zhì)量濃度為1.0mg/L的MRS-THIO培養(yǎng)基再分為3組,按3%接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液加入5mL蒸餾水稀釋,再用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值,以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,繪制生長(zhǎng)曲線.

1.7 培養(yǎng)基初始pH值降膽固醇能力的研究

分別加含有170 mg/L膽固醇的膽鹽質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基5 mL于6支干燥潔凈的試管,分別將pH值調(diào)節(jié)為3.0,4.0,5.0, 6.0,7.0,8.0,按3%接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測(cè)定方法測(cè)定其剩余的膽固醇質(zhì)量濃度,空白對(duì)照為不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

在牛膽鹽質(zhì)量濃度為1.0 mg/m L的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度不同的膽固醇,按照測(cè)定膽固醇方法測(cè)定吸光度,以吸光度(A550nm)為縱坐標(biāo),橫坐標(biāo)為膽固醇質(zhì)量濃度(mg/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖1.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.2 膽鹽質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響

膽鹽質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可知,膽鹽濃度對(duì)6種乳酸菌均有顯著性影響,糞腸球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌隨著膽鹽質(zhì)量濃度的增加,對(duì)膽固醇的降解能力均先下降后有所增加,在膽鹽質(zhì)量濃度為4～6mg/mL 時(shí),對(duì)膽固醇的去除能力達(dá)到最大值,分別為23.1%,33.8%,38.2%.當(dāng)膽固醇質(zhì)量濃度再增加時(shí),這四種乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力反而有所下降.發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在不加膽鹽時(shí)對(duì)膽固醇的去除能力最強(qiáng),去除率分別為32.6%,31.0%,當(dāng)加入膽鹽時(shí),去除率均顯著降低(P＜0.05).

圖2 膽鹽質(zhì)量濃度對(duì)膽固醇去除率的影響Fig.2 Effect of bile salt concentration on cholesterol removal rate

2.3 膽固醇質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響

膽固醇質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知,在膽固醇質(zhì)量濃度不同的MRS-THIO培養(yǎng)基中,不同質(zhì)量濃度的膽固醇對(duì)6種乳酸菌降解膽固醇的能力均有顯著性影響.隨著膽固醇質(zhì)量濃度的增加,6種乳酸菌降解膽固醇的能力均有所提高,當(dāng)膽固醇質(zhì)量濃度達(dá)到230mg/L時(shí),發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、糞場(chǎng)球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌去除膽固醇的能力均達(dá)到最大值,分別為33.5%,27.6%,27.4%,25.7%,39.0%.鼠李糖乳桿菌在膽固醇質(zhì)量濃度為190mg/L時(shí),對(duì)膽固醇的去除率最大,為30.9%,在膽固醇質(zhì)量濃度為230mg/L時(shí),鼠李糖乳桿菌對(duì)膽固醇的降解反而有所下降,去除率為27.7%.

圖3 膽固醇質(zhì)量濃度對(duì)膽固醇去除率的影響Fig.3 Effect of cholesterol concentration on cholesterol removal rate

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可知,pH值對(duì)6種乳酸菌降解膽固醇都有顯著的影響.發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在酸性環(huán)境中對(duì)膽固醇的去除能力較強(qiáng).發(fā)酵乳桿菌在pH值3.0 時(shí),對(duì)膽固醇的降解能力最強(qiáng),去除率達(dá)到53.8%;其次是嗜酸乳桿菌,在pH值3.0時(shí),對(duì)膽固醇的去除率為46.5%.隨著pH值＞4.0時(shí),這4種乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力均顯著下降(P＜0.05).而糞腸球菌隨pH值的增加,對(duì)膽固醇的降解能力先增加后下降,在pH值6.0時(shí),對(duì)膽固醇的去除率達(dá)到最大值30.0%.鼠李糖乳桿菌在中性環(huán)境中對(duì)膽固醇的降解能力最強(qiáng),在pH值7.0時(shí),對(duì)膽固醇的去除率為26.1%.

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)膽固醇去除率的影響Fig.4 Effect ofmedium initial pH on cholesterol removal rate

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌降膽固醇能力的影響

6種受試乳酸菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5,乳酸菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)其降膽固醇能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6可知,菌株的生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)膽固醇的降解能力有顯著影響.發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌在培養(yǎng)3 h時(shí)膽固醇的去除率分別為37.0%,36.1%, 29.9%,隨著菌株生長(zhǎng)時(shí)間的增加,這3種菌對(duì)膽固醇的去除能力均有所增加,在培養(yǎng)11～15 h時(shí)最早達(dá)到最佳去除率,此時(shí)膽固醇的去除率分別為43.0%,43.6%,41.7%.糞腸球菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)3 h時(shí)膽固醇的去除率分別為31.0%,32.1%,30.2%,在培養(yǎng)19 h后對(duì)膽固醇的去除能力迅速增加,培養(yǎng)23 h后去除能力迅速增加,此時(shí)膽固醇的去除率分別達(dá)到最高值為39.4%,43.0%,43.3%.

圖5 6種乳酸菌在MRS-THIO培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth curves of six kinds of lactic acid bacteria in the MRS-THIO medium

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)膽固醇去除率的影響Fig.6 Effect of incubation time on cholesterol removal rate

3 討論與結(jié)論

有研究表明,適量濃度的膽鹽可以使菌體細(xì)胞壁通透性增加,膽固醇被吸收至細(xì)胞內(nèi)部,而濃度過(guò)高的膽鹽會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng),因而不利于菌體細(xì)胞吸收膽固醇[8-10].本研究使用的測(cè)試的6種乳酸菌中保加利亞乳桿菌、糞腸球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌與之前的研究一致.

本研究中,在低膽固醇濃度下6種乳酸菌對(duì)膽固醇降解能力較差,隨著膽固醇濃度的增加,乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力隨之提高,如在膽固醇質(zhì)量濃度為30～70 mg/L時(shí)只有鼠李糖乳桿菌對(duì)膽固醇的去除率為2.3%,其他5種菌株對(duì)膽固醇的去除率菌均為0;在膽固醇質(zhì)量濃度大于110 mg/L時(shí),乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力明顯提高,原因并不明確,可能是因?yàn)椴煌陮?duì)膽固醇降解的機(jī)理不同[11].

pH值對(duì)乳酸菌降解膽固醇的能力有顯著影響.本實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在酸性環(huán)境中對(duì)膽固醇的去除能力較強(qiáng).而糞腸球菌在弱酸性環(huán)境中對(duì)膽固醇的降解能力較強(qiáng),鼠李糖乳桿菌在中性環(huán)境中對(duì)膽固醇的降解能力最強(qiáng).雖然目前對(duì)于乳酸菌降解膽固醇的機(jī)理尚無(wú)定論,但人們更多傾向于活體乳酸菌通過(guò)吸收和共沉淀聯(lián)合作用以降低膽固醇的觀點(diǎn)[12-13].Klaver 等[14]研究表明酸性環(huán)境對(duì)膽酸和膽固醇發(fā)生共沉淀現(xiàn)象有利,因此有利于膽固醇的降解.

此外,本研究還表明,菌株的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其降解膽固醇的能力具有顯著影響,隨著菌株生長(zhǎng)時(shí)間的增加這菌株對(duì)膽固醇的去除能力隨著增加.除了糞腸球菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳酸菌在培養(yǎng)23 h后對(duì)膽固醇的去除率達(dá)到最大值外,其余的3種菌株在培養(yǎng)11 h后對(duì)膽固醇的去除率就已達(dá)到最大值,這可能與不同菌種所需要活化的時(shí)間不同有關(guān).

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,受試6種乳酸菌對(duì)膽固醇均有一定的降解能力,乳酸菌對(duì)膽固醇的降解能力因膽鹽濃度、膽固醇濃度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間和菌株種類的不同而表現(xiàn)出較大的差異.其中發(fā)酵乳桿菌在膽鹽質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、膽固醇質(zhì)量濃度為170 mg/L、pH值3.0的MRS培養(yǎng)基對(duì)膽固醇的降解能力最強(qiáng),達(dá)到 53.8%;嗜酸乳桿菌次之,達(dá)到46.5%.

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Factors Influencing in vitro Cholesterol Removal Ability of Lactic Acid Bacteria

REN Dayong1, WENG Luchao1, LIU Hongfeng2, ZHOU Tingting1, ZHANG Zhenye1, SHAO Lifang1
(1.College ofFood Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;
2.College of Veterinary Medicine,Jilin University,Changchun 130062,China)

The aim of the present study was to evaluate the in vitro cholesterol removal ability of different lactic acid bacterial strains.Single factor experimentswere carried out to explore the influences of oxgall addition,cholesterol addition,medium pH,and incubation time on the cholesterol removal ability of the strains.The results showed that cholesterol removal rate was significantly affected by the above factors. Under the same conditions,considerable variation was found among lactic acid bacterial strainswith regard to the ability to assimilate cholesterol from a laboratory growthmedium.Generally,the highest cholesterol removal rate(more than 50%)was obtained under the condition of the oxgal concentration 4-6mg/mL, cholesterol concentration 190-230mg/L,medium initial pH 5-7,and incubation time 11-23 h.

lactic acid bacteria;cholesterol;influence factor;in vitro

李 寧)

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.05.008

2095-6002(2014)05-0041-05

2013-09-30

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130522175JH);吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(2012).

任大勇,男,副教授,博士,主要從事食品微生物方面的研究.