野百合堿在5 種肝微粒體中的體外代謝研究

劉 倩， 陳龍龍， 馬雙成， 張祖艷， 李云華， 錢 勇， 謝天培*

(1. 上海滬豐生物科技有限公司，上海200433;2. 上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，上海201203;3. 中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

吡咯里西啶生物堿(pyrrolizidine alkaloids，PAs)是自然界廣泛分布的天然有毒生物堿，主要分布在紫草科、菊科、豆科和蘭科等植物中。分布廣泛的吡咯里西啶生物堿可以通過間接的食物污染如谷物、牛奶、蜂蜜或牧草的污染或者直接通過含吡咯里西啶生物堿的傳統(tǒng)草藥、補(bǔ)劑、茶等對人類或牲畜生命造成極大的毒害［1］，主要表現(xiàn)為肝毒性及明顯的致癌、致突變等作用。吡咯里西啶生物堿riddelliine 已被美國衛(wèi)生部列為“可合理預(yù)期的人類致癌物”。Stickel 等［2］進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查表明，在南非、阿富汗、伊朗、牙買加、印度及前蘇聯(lián)等國家，大量肝病的發(fā)生與食用含PAs 的食物及草藥有關(guān)。在中國至少有40 多種常用中藥或民間藥物含有PAs。 《中國藥典》2010 年版一部(含附錄)收載了一些明確含有PAs 的藥材及其成方制劑，如千里光、款冬花、佩蘭、紫草、川貝雪梨膏等，臨床應(yīng)用廣泛［3］。PAs 本身沒有毒性，毒性主要來自其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物［4］。代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的親電性，能與組織中親核性的酶、蛋白質(zhì)、DNA，RNA 結(jié)合，引起各種損傷［5］。其中(+ /-)-6，7-二氫-7-羥基-1-羥甲基-5H-吡咯里嗪(DHP，包括DHR、DHH，結(jié)構(gòu)見圖1)形成的DNA加合物，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因［6］。

野百合堿 (monocrotaline，MCT，結(jié)構(gòu)見圖1)是一種具有致突變、致癌作用的肝毒性倒千里光裂堿型吡咯里西啶生物堿［7］，有抗腫瘤、抗膽堿等作用［4］。對其進(jìn)行代謝研究可以對藥理作用的發(fā)揮和代謝致毒解毒研究提供依據(jù)。Tang［8］等研究發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體中野百合堿基本未發(fā)生代謝。Wang 等［7］發(fā)現(xiàn)，野百合堿在用地塞米松誘導(dǎo)的F344 雌性大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物—DHP、N-氧化野百合堿的形成速率比未經(jīng)誘導(dǎo)的肝微粒體高兩倍。本實(shí)驗(yàn)對野百合堿在不同肝微粒體體系的代謝進(jìn)行了研究。

圖1 DHP，DHR，DHH，野百合堿的結(jié)構(gòu)

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相-G6460 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;渦旋振蕩器(Vortex-5，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);離心機(jī)(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲波清洗儀(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司);超速冷凍離心機(jī)(CP100MX，日本日立公司);高速冷凍離心機(jī)(H2050R，湘儀公司);ELGA 超純水系統(tǒng);水浴鍋。

1.2 試藥 野百合堿(上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)152/130304);脫氫野百合堿、野百合堿-N-氧化物、DHP (按文獻(xiàn)方法制備［9-14］，HPLC-MS 檢測);PBS 緩沖液(corning cellgro 公司，美國);NADPH (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四鈉鹽還原型，上海鼎國生物技術(shù)有限公司);BCA 蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);人肝微粒體(美國BD Gentest 公司20 人混合肝微粒體，批號(hào)99268);乙腈、甲酸銨、甲酸均為色譜純;水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性F344 大鼠6 只，ICR 小鼠17 只，SD大鼠4 只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 肝微粒體的制備 雌性F344 大鼠，連續(xù)3 d 以75 mg/kg的劑量腹腔注射地塞米松，末次給藥2 h 后禁食16 h，脫臼處死，取出肝臟(以下操作均在冰浴上進(jìn)行)，剪碎，按體積比1 ∶4 比例加入預(yù)冷的100 mmol/L Tris-乙酸緩沖液(pH 7.4，含100 mmol/L Kcl，1 mmol/L EDTA)，勻漿，4 ℃，10 000 g 離心20 min，取上清液，4 ℃，100 000 g離心60 min，棄去上清液。沉淀用50 mmol/L Tris-乙酸緩沖液(pH 7.4，含20% 甘油，0.1 mmol/L EDTA)懸浮，分裝，部分肝微粒體用BCA 法測定肝微粒體蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其余放入-80 ℃冰箱保存。測得肝微粒體蛋白為20 mg/mL。F344 大鼠、ICR 小鼠、SD 大鼠肝微粒體除不經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)外，同法制備。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件Agilent Zorbax Extend C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm);流動(dòng)相10 mmol/L 甲酸銨(0.1%甲酸調(diào)pH 為3)-乙腈(5 ∶95);體積流量0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描;檢測方式為定量分析，MRM ［野百合堿(m/z)326 →120，內(nèi)標(biāo)氧化苦參堿(m/z)265→136］;定性分析為全掃描及產(chǎn)物離子掃描;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣體積流量5 L/min;霧化器壓力45 psi (1 psi =6.895 kPa);鞘氣溫度400 ℃;鞘氣體積流量11 L/min。

2.3 野百合堿的體外代謝體系和處理方法 溫孵體系總孵育體積0.5 mL，含肝微粒體、1 mmol/L NADPH 及野百合堿。介質(zhì)為磷酸緩沖液(PBS)。配置好的溫孵液置于37 ℃振蕩孵育特定時(shí)間后立即取出，用等體積的冷乙腈終止反應(yīng)。取400 μL 樣品溶液，加100 μL 內(nèi)標(biāo)氧化苦參堿，渦旋震蕩后，10 000 ×g 離心10 min。過濾，LC-MS 檢測。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取不同質(zhì)量濃度野百合堿甲醇溶液，加到熱失活的F344 大鼠肝微粒體懸浮液中，使反應(yīng)液中野百合堿的最終質(zhì)量濃度為33.6、84、168、336、504、840、1 680、3 360、5 040、10 080 μg/L。按“野百合堿的體外代謝體系和處理方法”項(xiàng)操作，以野百合堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，野百合堿與內(nèi)標(biāo)峰氧化苦參堿面積比值為縱坐標(biāo)計(jì)算曲線的回歸方程為y =0.007 8x +0.025 3，r2=0.998 9。測得檢測下限為2.1 μg/L。野百合堿質(zhì)譜定量檢測(MRM 模式)見圖2。

圖2 野百合堿質(zhì)譜定量檢測

2.5 回收率和精密度試驗(yàn) 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的野百合堿溶液(420、840、1 680 μg/L)用于回收率和日內(nèi)日間精密度的測定。測得3 個(gè)質(zhì)量濃度的相對回收率分別為98.7%、99.2%和100.9%。3 個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD 分別為2.6%、3.4%、3.0% (n =6)，3 d 的日間精密度RSD 為5.3%、4.8%、4.1% (n=6)。

2.6 肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度對代謝速率的影響 地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度在0.2 ～2 mg/mL 范圍內(nèi)，野百合堿質(zhì)量濃度為1 680 μg/L，溫孵時(shí)間為60 min時(shí)，隨著肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度的增大，野百合堿代謝速率增大(見圖3)。最終選擇肝微粒體質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

2.7 溫孵時(shí)間對野百合堿代謝速率的影響 地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體質(zhì)量濃度為2 mg/mL。樣品37 ℃孵育0、30、60、90、120 min，LC-MS 檢測野百合堿的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明在90 min 后，野百合堿質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定(見圖4)。最終確定孵育時(shí)間為90 min。在此條件下野百合堿的代謝率為9.91%。野百合堿代謝率以被代謝的野百合堿的量和加入野百合堿的量的比值進(jìn)行計(jì)算。

圖3 肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度對代謝速率的影響

圖4 溫孵時(shí)間對野百合堿代謝率的影響

2.8 不同來源肝微粒體體外代謝率和產(chǎn)物鑒定 在代謝體系中分別加入人、SD 大鼠、F344 大鼠、經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠和ICR 小鼠的肝微粒體使蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，野百合堿終濃度為5 μmol/L，37 ℃振蕩孵育，90 min取出，按“野百合堿的體外代謝體系和處理方法”項(xiàng)操作，LC-MS 檢測。在人、SD 大鼠、F344 大鼠、經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠和ICR 小鼠肝微粒體中野百合堿代謝率分別為0.25%、1.01%、5.45%、9.91%和4.25%。在各體系中除檢測到m/z 326 的野百合堿外，還檢測到m/z 342的準(zhǔn)分子離子峰，通過與合成得到的對照品進(jìn)行質(zhì)譜對比，確定為野百合堿-N-氧化物。此外，還檢測到m/z 136的代謝產(chǎn)物，通過與合成得到的DHP 進(jìn)行質(zhì)譜對比，確定為DHP。幾種肝微粒體代謝體系中均未檢測到脫氫野百合堿。在失活肝微粒體樣品體系中只檢測到野百合堿，未檢測到野百合堿-N-氧化物和DHP。

3 討論

由于野百合堿的代謝產(chǎn)物——野百合堿-N-氧化物及DHP 的量較低，實(shí)驗(yàn)未對其進(jìn)行測定。在未經(jīng)誘導(dǎo)的F344大鼠、人、大鼠、小鼠肝微粒體中，野百合堿的代謝率均較低，其中在F344 大鼠、小鼠肝微粒體中的代謝相對較高。經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體能提高野百合堿的代謝，文獻(xiàn)也報(bào)道經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后的F344 大鼠肝微粒體能增加代謝產(chǎn)物——野百合堿-N-氧化物及DHP 的形成。因此在代謝影響因素實(shí)驗(yàn)中采用經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體進(jìn)行。地塞米松是CYP3A4 酶的經(jīng)典誘導(dǎo)劑，對人及大鼠的CYP3A4/1 均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用［15］。還有研究表明地塞米松對CYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1 和3A4 6 種同工酶均有誘導(dǎo)作用［16］?？梢哉J(rèn)為，誘導(dǎo)CYP450 酶能增加野百合堿的代謝，但參與其代謝的亞型還需進(jìn)行深入研究。

圖5 野百合堿-N-氧化物、DHP 子離子掃描

由于人經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的肝微粒體無法獲得，為了進(jìn)行比較，所以大鼠、小鼠的肝微粒體也沒有進(jìn)行誘導(dǎo)，由于野百合堿的代謝率較低，因此在條件摸索時(shí)用代謝率相對較高的經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體進(jìn)行，并且通過與未經(jīng)誘導(dǎo)的F344 大鼠肝微粒體進(jìn)行比較，能看出經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后確實(shí)能增加野百合堿的代謝，這為以后研究參與野百合堿代謝的P450 同工酶亞型提供參考依據(jù)。

在人、大鼠、小鼠、F344 大鼠肝微粒體體系中均檢測到DHP，而DHP 是肝毒性吡咯里西啶生物堿的毒性代謝產(chǎn)物，表明野百合堿在人、SD 大鼠、ICR 小鼠、F344 大鼠體內(nèi)均有可能引起毒性，形成DNA 加合物。至于哪些酶參與了DHP 的生成，尚需進(jìn)一步研究。

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