化濁解毒方對(duì)濁毒內(nèi)蘊(yùn)型反流性食管炎大鼠黏膜腦腸肽及胃腸激素的影響

趙 艷， 馮玉彥

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊050011)

反流性食管炎(Reflux Esophagitis，RE)是一種胃食管反流病，由胃、十二指腸內(nèi)容物，主要是酸性胃液或是酸性胃液加膽汁反流至食管所引起的食管黏膜的炎癥、糜爛、潰瘍的病變。隨著胃鏡檢測(cè)的普及、生活節(jié)奏加快、工作壓力增大和飲食結(jié)構(gòu)改變，此病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。RE 反復(fù)發(fā)作引起B(yǎng)arrett 食管與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)，因此越來(lái)越受到重視。筆者在臨床應(yīng)用化濁解毒方治療該病取得較好療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察該方對(duì)濁毒內(nèi)蘊(yùn)反流性食管炎大鼠血清胃泌素 (GAS)、胃動(dòng)素(MTL)及黏膜血管活性腸肽(VIP)、P 物質(zhì)(SP)表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討該方治療RE 的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12 周齡清潔級(jí)Wistar 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量250 ～320 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK (冀)2008-1-003。

1.2 藥物和試劑 公英15 g、連翹20 g、半邊蓮15 g、半枝蓮15 g、絞股藍(lán)15 g、白花蛇舌草15 g、黃芩9 g、石菖蒲15 g、紫豆蔻6 g、佩蘭12 g、藿香12 g、茯苓20 g、枳實(shí)12 g、厚樸12 g、砂仁12 g。所需藥物均購(gòu)自河北省中醫(yī)院，以上藥物先經(jīng)蒸餾水浸泡2 h，煎煮2 次 (30 min/次)后，過濾，合并濾液，再水浴濃縮成1.25 g/mL藥液備用。奧美拉唑腸溶片由湖南方盛制藥有限公司生產(chǎn)，并以蒸餾水配制成0.36 mg/mL 的溶液備用。胃泌素(GAS)、胃動(dòng)素(MTL)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，由上海源葉生物科技有限公司提供。血管活性腸肽(VIP)、P 物質(zhì)(SP)即用型SABC 免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將60 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、化濁解毒方組，每組15 只，除空白組外，其余各組大鼠采用“不全幽門結(jié)扎+賁門肌切開術(shù)”并配合濕熱環(huán)境加高脂高糖飲食的綜合方法制作RE 動(dòng)物模型。

2.2 造模 參考文獻(xiàn)［1-2］制備大鼠模型。(1)造模前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，術(shù)前24 h 內(nèi)禁食 (但不禁水)，將3.5%水合氯醛(按1 mL/100 g)注射到腹腔，進(jìn)行麻醉，取仰臥位將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)備皮、消毒，沿上腹部正中線切開約3 cm，將食管下段及胃食管交界區(qū)完全暴露，用0 號(hào)縫合線結(jié)扎胃-食管交界處的胃左動(dòng)脈分支，防止造模過程中因切開賁門肌而出血，取食管-胃交界處縱行切開賁門肌約0.5 cm，分離使切開的賁門部位黏膜層完全暴露于視野中，使反流的作用效果更強(qiáng)。然后避開血管結(jié)扎幽門與十二指腸交界近幽門部，為防止感染，關(guān)腹前做消毒處理，將生理鹽水1 mL 及慶大霉素1 萬(wàn)IU 注入腹腔，大鼠術(shù)后禁食(不禁水)24 h。(2)除空白組外，其他各組大鼠飼養(yǎng)于潮濕高熱的環(huán)境中，飼以高脂高糖飲食，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每日每只加用10% 蜂蜜，10%白糖混合飲料自由飲用，術(shù)后3 周即造模成功。

2.3 給藥方法 造模3 周后開始給藥，空白組、模型組均按1 mL/100 g 給予生理鹽水灌胃;陽(yáng)性藥組按1 mL/100 g(即按3.6 mg/kg)給予奧美拉唑溶液灌胃;化濁解毒方組按1 mL/100 g (即按12.5 g/kg)給予化濁解毒方灌胃。以上各組均每日給藥1 次，共治療8 周。

2.4 標(biāo)本采集與處理 治療8 周后，禁食不禁水24 h，使用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 行腹腔注射麻醉。每只大鼠從門靜脈取血4 mL，注入含有7.5%EDTA 二鈉30 μL 和抑肽酶40 μL 的試管中混勻，在4 ℃3 000 r/min 條件下離心10 min，抽取上清液置-80 ℃冷藏箱內(nèi)待測(cè)。處死大鼠，取各組大鼠食管下段標(biāo)本，放入10%甲醛固定24 h 后脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，一部分常規(guī)HE 染色，另一部分免疫組化監(jiān)測(cè)。

2.5 觀測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.5.1 食管黏膜病理組織觀察 參照2003 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡學(xué)分會(huì)制定的“反流性食管炎診斷及治療指南”中反流性食管炎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):鱗狀上皮增生、黏膜固有層乳頭延伸、上皮細(xì)胞層內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)為輕度;輕度基礎(chǔ)上出現(xiàn)黏膜糜爛為中度;輕度基礎(chǔ)上有潰瘍形成和(或)Barrett 食管改變?yōu)橹囟龋?］。

2.5.2 胃腸激素水平檢測(cè) 取分離備用血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定GAS、MTL 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。操作步驟:設(shè)置空白對(duì)照(血清樣本稀釋液)，將對(duì)照品各50 μL 依次加入孔中，其余各孔加樣品血清50 μL。樣品孔中加入生物素標(biāo)記液10 μL，在對(duì)照品孔和樣品孔中加入酶標(biāo)記液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后放置36 ℃溫育1 h。用洗滌液將反應(yīng)板清洗5 次后每孔加入底物A，B 液各50 μL，36 ℃避光暗處溫育反應(yīng)15 min。每孔加入50 μL 終止液混勻。TECAN 多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度 (A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算GAS、MTL含量。

2.5.3 食管黏膜中VIP 及SP 表達(dá)的檢測(cè) 采用SABC 法，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。操作步驟:脫蠟沖洗組織切片后，浸泡入3%H2O2約10 min，修復(fù)抗原后用PBS 洗5 min，加入血清封閉液，放入溫箱(37 ℃)0.5 h。滴加Ⅰ抗，置37 ℃溫箱1 h。從溫箱中取出用PBS 洗3 次每次5 min。滴加Ⅱ抗，37 ℃溫箱30 min 后PBC 洗3 次每次5 min。滴加試劑SABC，37 ℃0.5 h 后用PBS 洗4 次每次5 min。加DAB 顯色，蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2 min、鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。進(jìn)行食管黏膜中VIP及SP 表達(dá)的檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)資料進(jìn)行分析處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s 表示，采用t 檢驗(yàn);等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

4 結(jié)果

4.1 食管黏膜病理組織觀察 由表1 可見，化濁解毒方組、陽(yáng)性藥對(duì)照組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)，均能改善食管黏膜病理變化。

表1 各組大鼠病理分級(jí)比較

4.2 各組胃腸激素水平比較 由表2 可見，反流性食管炎大鼠模型組血清GAS 水平顯著下降(P ＜0.05)，而MTL水平無(wú)明顯變化(P ＞0.05)。與模型組比較，化濁解毒方組血清GAS、MTL 水平顯著升高(P ＜0.05)，而陽(yáng)性藥對(duì)照組僅血清GAS 水平升高(P ＜0.05)，MTL 變化不明顯(P ＞0.05)。

表2 各組大鼠血GAS 及MTL 水平的比較(±s)

表2 各組大鼠血GAS 及MTL 水平的比較(±s)

注:與空白組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 例數(shù) GAS/(ng·L -1) MTL/(ng·L -1)15 56.72 ±5.31 136.58 ±7.54模型組 13 40.98 ±3.17* 141.61 ±9.36陽(yáng)性藥組 14 68.62 ±4.96＊△ 139.78 ±8.91化濁解毒方組 14 65.26 ±4.43＊△ 163.16 ±9.12空白組△

4.3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達(dá)比較 由表3 可見，模型組大鼠食管黏膜VIP 表達(dá)升高，SP 表達(dá)降低，與空白組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。化濁解毒方組與陽(yáng)性藥組大鼠食管黏膜VIP 表達(dá)降低，SP 表達(dá)升高，與模型組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)?；瘽峤舛痉浇M與陽(yáng)性藥組比較，SP 表達(dá)升高，有顯著性差異(P ＜0.05);而VIP表達(dá)，兩者比較無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠食管黏膜VIP、SP 表達(dá)比較(±s)

注:與空白組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.05;與陽(yáng)性藥組比較，△P ＜0.05

組別 例數(shù)VIP SP空白組15 82.05 ±9.28 164.56 ±9.43模型組 13 142.51 ±11.48* 122.83 ±11.32*陽(yáng)性藥組 14 101.02 ±13.62＊＊ 138.33 ±13.54＊＊化濁解毒方組 14 103.38 ±12.16＊＊ 156.07 ±10.83＊＊△

5 討論

反流性食管炎是消化系統(tǒng)常見病，主要是胃和十二指腸內(nèi)容物反流至食管所引起的食管黏膜病變。本病病程較長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)作，治療難度較大。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RE 發(fā)病機(jī)理為抗反流防御機(jī)制減弱和反流物對(duì)食管黏膜攻擊作用的結(jié)果，而防御機(jī)制的減弱與下食管括約肌壓力下降、食管胃動(dòng)力障礙相關(guān)［4］。胃泌素(GAS)和胃動(dòng)素(MTL)是重要的胃腸激素［5］。GAS 是由胃竇及十二指腸黏膜開放型G 細(xì)胞分泌，有保護(hù)胃黏膜和促進(jìn)胃腸道分泌的功能，對(duì)胃排空有重要作用［6］。MTL 是由22 個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，具有促進(jìn)胃腸收縮及小腸分解運(yùn)動(dòng)提高食管下括約肌緊張性的作用［7］，有助于胃腸運(yùn)動(dòng)和胃排空。MTL、GAS、P 物質(zhì)(SP)等可增強(qiáng)下食管括約肌;血管活性腸肽(VIP)、生長(zhǎng)抑素、抑胃肽等可減弱下食管括約肌［8］。相關(guān)研究表明:GAS 和MTL 的異常降低可導(dǎo)致胃排空障礙，致使胃酸反流引發(fā)該?。?-10］。而VIP 為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要以神經(jīng)分泌方式作用于下食管括約肌，為介導(dǎo)其松弛的重要原因之一;SP 則為主要興奮性肽能神經(jīng)遞質(zhì)，其胞體發(fā)出纖維達(dá)到食管壁各層，興奮時(shí)可引起下食管括約肌收縮，SP 神經(jīng)元減少或功能降低，VIP 神經(jīng)元的異常升高是RE 發(fā)病機(jī)制之一［11］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化濁解毒方能夠降低大鼠食管黏膜VIP 表達(dá)，升高血清GAS、MTL 水平及黏膜SP 表達(dá)，改善大鼠病理?yè)p傷，說明本方可能是通過雙向調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)正負(fù)相關(guān)因子而達(dá)到治療效果。

對(duì)于本病的治療目前西醫(yī)主要采用抑酸藥、促胃動(dòng)力藥物對(duì)癥治療，短期療效較好，但癥狀易復(fù)發(fā)，需長(zhǎng)期用藥維持治療，患者依從性較差。中醫(yī)藥治療RE 從整體觀念出發(fā)，通過辨證論治對(duì)本病的病因、病機(jī)及診療有系統(tǒng)而獨(dú)特的見解，課題組經(jīng)多年臨床研究發(fā)現(xiàn)RE 病因多為六淫傷中，情志不遂，飲食不適而內(nèi)傷脾胃，中焦失司，氣機(jī)郁滯，逆亂失和，脾胃不能升清降濁，則水反為濕，谷反為滯，濕滯日久化生熱毒，濕熱毒邪互結(jié)而釀生濁毒。病機(jī)常表現(xiàn)為氣機(jī)郁滯、濕熱內(nèi)阻、濁毒內(nèi)蘊(yùn)、瘀血停滯、陰液虧虛，可單一為病又多相兼為害，而濕濁和熱毒是本病發(fā)病和病機(jī)演變的關(guān)鍵?；诖苏n題組采用化濁解毒方治療該病。方中重用石菖蒲、砂仁化濕和胃健脾。公英、連翹清熱解毒，公英兼以利濕，連翹又可輕宣郁熱取“火郁發(fā)之”之意。上四味共為君藥。紫豆蔻、藿香、佩蘭增強(qiáng)君藥醒脾開胃，芳香化濕和胃之效;黃芩、半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草助君藥清熱解毒祛濕，共為臣藥。絞股藍(lán)、茯苓益氣健脾滲濕，化濕可祛脾病之因，健脾可絕生濕之本;配以枳實(shí)、厚樸理氣消痞，降逆除脹，而復(fù)脾胃升清降濁之功，同為佐使藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化濁解毒方針對(duì)本病關(guān)鍵病機(jī)濁毒用藥，標(biāo)本兼治，使?jié)嵝办?，毒邪解。能夠促進(jìn)GAS、MTL 的分泌，進(jìn)而促進(jìn)胃腸的運(yùn)動(dòng)，降低反流物對(duì)食管的損傷。同時(shí)提高SP 表達(dá)，降低VIP 的表達(dá)，起到雙向調(diào)節(jié)作用，既能夠降低胃酸侵害，抗氧化、抗菌抗炎從而減輕對(duì)食管黏膜的破壞，又能夠增強(qiáng)免疫力、提高保護(hù)機(jī)制進(jìn)而加強(qiáng)自身抗病和修復(fù)能力，使食管黏膜得以修復(fù)。

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