HPLC 法測(cè)定4 種細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素

宋雙紅， 色林格， 陳 蓓， 崔浪軍， 商 澎*

(1. 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安710072;2. 西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq. var. seoulense Nakai 或華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq. 的干燥根及根莖［1］。前兩種習(xí)稱“遼細(xì)辛”。夏季果熟期或初秋采挖，除去地上部分和泥沙，陰干。細(xì)辛性溫味辛，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、止咳平喘、溫肺化陰等功效［2］。陜西省是細(xì)辛主產(chǎn)區(qū)，其原植物有4 種:華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細(xì)辛Asarum debile Franch.、毛 細(xì) 辛 Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和雙葉細(xì)辛Asarum caulescens Maxim。由于目前中醫(yī)習(xí)慣使用的遼細(xì)辛及華細(xì)辛藥源短缺，以致民間有把毛細(xì)辛和銅錢細(xì)辛作為代用品使用的情況發(fā)生。2005 年版及以前《中國(guó)藥典》僅以揮發(fā)油作為細(xì)辛藥材質(zhì)量控制指標(biāo)。《中國(guó)藥典》2010 年版中增加了馬兜鈴酸Ⅰ限量測(cè)定及細(xì)辛脂素的測(cè)定。因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，對(duì)華細(xì)辛、毛細(xì)辛、銅錢細(xì)辛及遼細(xì)辛不同部位馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素進(jìn)行了測(cè)定和比較，為細(xì)辛藥材的合理用藥和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀(shimadzu LC-2010A)，超聲波清洗器(KQ-600DB)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent1100-Esquire 6000)，MILLI-Q超純水儀，電子天平等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 對(duì)照品馬兜鈴酸Ⅰ (批號(hào)110746-200507)，細(xì)辛脂素(批號(hào)111889-201001)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 藥材均采自陜西省寧強(qiáng)縣黃壩驛鎮(zhèn)，由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分類研究室田先華教授鑒定，分別為馬兜鈴科植物華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.、銅錢細(xì)辛Asarum debile Franch.、毛細(xì)辛Asarum himalaicum Hook. F. et Thoms 和遼細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.)Kitag. 的干燥全草。樣品保存于陜西師范大學(xué)植物標(biāo)本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 MERCK C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 uL;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;以乙腈(A)-0.05% 磷酸水 (B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0 ～20 min，30%→45%A;20 ～30 min，45%A;30 ～35 min，45% →55% A;35 ～45 min，55% →75%A)，對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)及細(xì)辛樣品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and sample (B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定馬兜鈴酸Ⅰ對(duì)照品2.34 mg，細(xì)辛脂素對(duì)照品1.95 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，超聲處理5 min使樣品溶解，待冷卻后得對(duì)照品貯備液。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱定60 ℃干燥至恒重的細(xì)辛樣品粉末0.63 g (過(guò)100 目篩)，置于25 mL錐形瓶中，精確加入70%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，密封，超聲(500 W，40 kHz)處理45 min，取出并冷卻至室溫，稱定并補(bǔ)足損失的質(zhì)量。進(jìn)樣前搖勻，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)制備的馬兜鈴酸Ⅰ貯備液，精確稀釋至0.01、0.1、1、10、60、110、160、250 μg/mL，分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y = 1 × 106X - 322.25 (r =0.999 7)，結(jié)果表明馬兜鈴酸Ⅰ在0.01 ～250 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

同樣取細(xì)辛脂素貯備液，稀釋至0.6、6、60、90、120、150、200 μg/mL，分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y =1 ×106X -9 342.4 (r =0.999 7)，結(jié)果表明細(xì)辛脂素在0.6 ～200 μg/mL之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測(cè)得馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素峰面積積分值的RSD 分別為2.5%和0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份細(xì)辛樣品按“2.3”項(xiàng)方法制備5 份樣品，連續(xù)進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素的峰面積積分值的RSD 分別為0.5%和0.6%，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、2、4、10 h 進(jìn)樣，測(cè)定馬兜鈴酸Ⅰ峰面積RSD 為2.6%，細(xì)辛脂素峰面積RSD 為0.8%，表明樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素在10 h 內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足本方法測(cè)定時(shí)間上的要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含有量華細(xì)辛根作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別準(zhǔn)確加入對(duì)照品(馬兜鈴酸Ⅰ160 μg/mL，細(xì)辛脂素120 μg/mL)0.25，0.5 及1.0 mL，按“2.3”項(xiàng)方法制作供試品，依“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算馬兜鈴酸Ⅰ (表1)和細(xì)辛脂素 (表2)的加樣回收率［15］。

表1 馬兜鈴酸Ⅰ加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for aristolochic acid Ⅰ

表2 細(xì)辛脂素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for asarinin

2.9 樣品測(cè)定 分別取4 種細(xì)辛不同部位樣品，按“2.3”項(xiàng)樣品制備方法操作，得各供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜方法測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Content of aristolochic acid Ⅰand asarinin in different samples (n=3)

3 質(zhì)譜鑒定

樣品中馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛酯素的量都比較低，本實(shí)驗(yàn)在采用對(duì)照品驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，又通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了驗(yàn)證，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.1 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，霧化氣壓為35 psi(1 psi =6.895 kPa)，干燥氣流量為11 mL/min，干燥溫度為350 ℃，質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍為50 ～500。采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜和選擇離子掃描二級(jí)質(zhì)譜兩種方式同時(shí)測(cè)定。色譜條件同“2.1”項(xiàng)。

3.2 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果 馬兜鈴酸Ⅰ(相對(duì)分子質(zhì)量341.27，結(jié)構(gòu)式見圖2，質(zhì)譜圖見圖3) ［M-H］-離子m/z 340，碎片離子m/z 分別為340、324、293;細(xì)辛脂素(相對(duì)分子質(zhì)量354.35，結(jié)構(gòu)式見圖4，質(zhì)譜圖見圖5)［M-H］-離子m/z 353，碎片離子m/z 分別為353、339、310。

圖2 馬兜鈴酸Ⅰ結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of aristolochic acid Ⅰ

4 討論

圖3 馬兜鈴酸Ⅰ質(zhì)譜圖Fig.3 MS chromatogram of aristolochic acid Ⅰ

圖4 細(xì)辛脂素結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure of asarinin

圖5 細(xì)辛脂素質(zhì)譜圖Fig.5 MS chromatogram of asarinin

4.1 馬兜鈴酸又名增噬力酸或木通甲素，在馬兜鈴屬植物中普遍存在并且在個(gè)別的幾種中含有量較大。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了不少因服用過(guò)量含馬兜鈴酸的中草藥而導(dǎo)致腎衰竭的病例，引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注［3］?！吨袊?guó)藥典》2005 年版起，已不再收錄廣防己、關(guān)木通、青木香等含有馬兜鈴酸的中藥方，并使用其他品種替代。此外，對(duì)其他含馬兜鈴酸生藥的藥用部位也進(jìn)行了更改。如《中國(guó)藥典》2000 年版以前細(xì)辛的藥用部位均為“全草”，但后來(lái)考慮到細(xì)辛地上部分馬兜鈴酸含有量較高，且古代中醫(yī)一直僅使用根部， 《日本藥局方》也僅用“根和根莖”，所以《中國(guó)藥典》2005年起將藥用部位修訂為根和根莖。 《中國(guó)藥典》2010 年版進(jìn)一步對(duì)細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)行限量測(cè)定［1］。多年來(lái)對(duì)于細(xì)辛中是否含有馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅰ含有量多少及其腎毒性的文獻(xiàn)報(bào)道不一，有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)辛藥材中不含有馬兜鈴酸Ⅰ［4］，也有文獻(xiàn)報(bào)道馬兜鈴酸在華細(xì)辛、北細(xì)辛、單葉細(xì)辛中含有量甚微，只有關(guān)木通、廣防己、青木香所含馬兜鈴酸的0.15% ～4.8%［5］。因此需要對(duì)不同種細(xì)辛中馬兜鈴酸進(jìn)行定量測(cè)定，為安全用藥提供參考。

4.2 細(xì)辛脂素也廣泛存在于馬兜鈴科的植物中，是細(xì)辛中的非揮發(fā)性成分，具有抗病毒和抗結(jié)核桿菌的作用［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)辛脂素對(duì)免疫有抑制性作用，能夠產(chǎn)生保護(hù)受體器官的作用［7］。近年來(lái)對(duì)細(xì)辛中細(xì)辛脂素的定量測(cè)定鮮有報(bào)道?！吨袊?guó)藥典》2010 年版將細(xì)辛脂素作為細(xì)辛藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。因此有必要建立并測(cè)定細(xì)辛中細(xì)辛脂素的量，為細(xì)辛藥材質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

4.3 本實(shí)驗(yàn)提取溶劑及提取方法的選擇以華細(xì)辛為研究對(duì)象，分別比較了甲醇、70%甲醇和乙醇為提取溶劑，超聲和熱回流的提取效果。結(jié)果4 種溶劑的提取率無(wú)顯著差異，超聲提取的效果優(yōu)于回流提取，且快速省時(shí)，故采用70%甲醇為溶劑，超聲提取45 min。

4.4 色譜條件的選擇和優(yōu)化參照文獻(xiàn)［8］，比較了流動(dòng)相甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-磷酸水分離效果較佳，故采用乙腈-磷酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相。細(xì)辛脂素在287 nm 波長(zhǎng)下吸光值較高，但在260 nm 波長(zhǎng)下馬兜鈴酸和細(xì)辛脂素均具有較高靈敏度［9］，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選用260 nm。該法可以同時(shí)檢測(cè)兩種待測(cè)成分，且達(dá)到基線分離，符合定量測(cè)定的要求［10］。

4.5 《中國(guó)藥典》2010 年版對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ進(jìn)行了限量，依高效液相色譜法測(cè)定，按干燥品計(jì)算，馬兜鈴酸Ⅰ的含有量不得過(guò)0.001%。而細(xì)辛脂素作為細(xì)辛的指標(biāo)成分之一，按干燥品計(jì)算，含細(xì)辛脂素不得少于0.050%［1］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，根和莖中馬兜鈴酸Ⅰ的量都低于《中國(guó)藥典》2010 年版規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，葉中含有量較高，故以根及根莖入藥是比較安全的。細(xì)辛脂素在華細(xì)辛和遼細(xì)辛根、莖、葉中均檢測(cè)到，但在毛細(xì)辛中未檢測(cè)出，銅錢細(xì)辛除莖外，也未測(cè)出細(xì)辛脂素。可見不同種細(xì)辛中馬兜鈴酸Ⅰ和細(xì)辛脂素的量差別較大，且同一種細(xì)辛地上部分和地下部分馬兜鈴酸Ⅰ的量亦有較大差別，提示用藥上應(yīng)合理取材。有文獻(xiàn)分析比較同一產(chǎn)地華細(xì)辛、毛細(xì)辛和銅錢細(xì)辛的揮發(fā)性成分。結(jié)果3 種細(xì)辛揮發(fā)性成分在數(shù)量和含有量上各有差異，此外3 種細(xì)辛均含有獨(dú)特的揮發(fā)性成分［11-13］。全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量需綜合多種揮發(fā)性成分及非揮發(fā)性成分［14］。從臨床用藥安全考慮，建議廠家應(yīng)對(duì)細(xì)辛藥材進(jìn)行用藥部位篩選和馬兜鈴酸的限量檢查，既要保證藥效，又要保證毒性成分的用量在允許范圍內(nèi)。

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