HPLC 法同時(shí)測定烏杞明目口服液中6 種成分

劉 靜， 談瑄忠 ， 陸兔林* ， 毛春芹， 寧子琬， 季 琳

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023;2. 南京市中醫(yī)院，江蘇 南京210001)

烏杞明目口服液由制何首烏、枸杞子、三七、蒲黃、丹參、赤芍組成，具有滋腎平肝、活血化瘀之功效。臨床用于治療陰虛血瘀型糖尿病視網(wǎng)膜病變。該方中制何首烏和枸杞子滋腎平肝、益精明目為君，制何首烏中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷抑制血小板聚集、抗炎、降血脂、保護(hù)肝臟［1-2］;三七、蒲黃化瘀止血為臣，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1是三七總皂苷止血和活血的主要有效成分［3］，香蒲新苷為蒲黃的有效成分;丹參、赤芍活血化瘀為佐，丹酚酸B 是丹參改善微循環(huán)、抑制血栓素形成和血小板黏附和聚集的活性成分之一［4］，芍藥苷是赤芍的主要有效成分，能夠降血糖和抑制血小板聚集［5］。

在質(zhì)量控制方面，單獨(dú)測定上述6 種有效成分的方法比較多［6-10］。因此，根據(jù)中醫(yī)整體性理論，為了能全面評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測定2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、香蒲新苷、芍藥苷、丹酚酸B 這6 種有效成分的量，為烏杞明目口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀(Waters 2998 檢測器)，Empower 色譜工作站;Milli-Q Intergral 水 純 化 系 統(tǒng) (美 國 Millipore 公 司);MS105DU 型電子分析天平(梅特勒-托利多公司);HH-S 型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2 試藥 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號(hào)110844-201109)、人參皂苷Rb1對照品(批號(hào)110704-201122)、丹酚酸B對照品(批號(hào)111562-201212)均購自中國食品藥品檢定研究院，人參皂苷Rg1對照品 (批號(hào)110703-201027)、芍藥苷對照品 (批號(hào)110736-200934)、香蒲新苷對照品(批號(hào)111573-200402)均購自中國藥品生物制品檢定所。烏杞明目口服液為醫(yī)院制劑(批號(hào)為131015、131017、131019)，制劑規(guī)格為每瓶裝10 mL;乙腈、甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密量取芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1對照品適量，分別加50%甲醇制成每1 mL 含芍藥苷0.959 9 mg、香蒲新苷1.000 mg、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.984 9 mg、人參皂苷Rg10.972 6 mg、丹酚酸B0.955 0 mg、人參皂苷Rb10.746 9 mg 的對照品貯備液。

分別取上述對照品貯備液適量，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL 含芍藥苷95.99 μg、香蒲新苷25.00 μg、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡 萄 糖 苷 29.55 μg、人 參 皂 苷 Rg178.81 μg、丹 酚 酸 B95.50 μg、人 參 皂 苷 Rb174.69 μg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液 精密量取烏杞明目口服液0.5 mL，置5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，離心，取上清液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別制備缺制何首烏、缺三七、缺丹參、缺蒲黃、缺赤芍的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)方法操作得陰性對照溶液。

2.4 色譜條件 采用Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液 (B)為流動(dòng)相，梯度洗脫 (0 ～10 min，10% ～18%A;10 ～20 min，18%A;20 ～25 min，18% ～22%A;25 ～40 min，22% ～23%A;40 ～65 min，23% ～36%A);體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長203 nm、230 nm;柱溫25 ℃。在上述色譜條件下，芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1的分離度均大于1.5。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在本色譜條件下，供試品溶液中各被測組分分離良好，且陰性對照溶液對各被測組分無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.2 mL 置2 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，記錄各峰面積。以峰面積Y 對質(zhì)量濃度X (μg/mL)進(jìn)行線性回歸分析，得到芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 6 種有效成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 Regression equation，correlation coefficient and linearity range of six compounds

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，計(jì)算芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為1.6%、2.6%、0.5%、2.4%、0.4%、0.5%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)為131015)，室溫放置0、4、8、12、16、24 h，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測得芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為 1.6%、0.9%、1.9%、1.2%、1.2%、2.5%。結(jié)果表明供試品溶液中上述6 個(gè)成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品 (批號(hào)為131015)，按“2.2”項(xiàng)下方法，平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件測定。芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1的平均含有量分別為304.1、57.48、73.29、355.0、336.9、259.6 μg/mL，RSD 為 1.1%、1.1%、0.9%、2.3%、0.7%、1.3%，表明本方法重復(fù)性好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取6 種對照品適量，置同一量瓶中，配置成芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別 為 76.79、 14.00、 18.13、 89.08、 85.95、66.89 μg/mL的混合對照品溶液，備用。取已知含有量的同一批(批號(hào)為131015)烏杞明目口服液0.25 mL，共9 份，平均分成3 組，分別加入混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各回收率。結(jié)果見表2。

2.11 樣品測定 分別精密量取3 個(gè)批次的烏杞明目口服液0.5 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中6 種成分的量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1的最大吸收波長分別是230、254、320、203、286、203 nm［11］。本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器在200 ～400 nm 處進(jìn)行掃描，選擇對人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1均有較好響應(yīng)的203 nm 和對芍藥苷、香蒲新苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、丹酚酸B均有較好響應(yīng)的波長230 nm 作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的比較 比較了甲醇、水、乙醇作為稀釋溶劑的提取效果，結(jié)果顯示，以水為稀釋溶劑時(shí)有效成分的提取率較低，且雜質(zhì)較多;以乙醇為稀釋溶劑時(shí)，芍藥苷和香蒲新苷較難達(dá)到基線分離;以甲醇為稀釋溶劑時(shí)各有效成分均達(dá)到較好的分離效果，且成分含有量較高，故選擇甲醇為提取溶劑。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

表3 樣品測定結(jié)果Tab.3 Determination results of the samples

3.3 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［12-14］報(bào)道，實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等多個(gè)系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-磷酸水溶液分離效果較好;考察磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) (0.01%、0.05%、0.1%)，結(jié)果表明0.1% 磷酸水溶液時(shí)的峰形良好。因此，選擇乙腈-0.1% 磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.4 溫度的選擇 參考文獻(xiàn)［15］，對柱溫進(jìn)行了考察(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，結(jié)果表明30 ℃、35 ℃時(shí)人參皂苷Rg1的分離效果較差，而25 ℃時(shí)可以達(dá)到較好的分離。因此，柱溫選擇25 ℃。

［1］ Xiang K，Liu G，Zhou Y J，et al. 2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(THSG)attenuates human platelet aggregation，secretion and spreading in vitro［J］. Thromb Res，2014，133(2):211-217.

［2］ 王玉琴，沈 燕，王春華，等. 2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈胞間粘附分子Ⅰ、血管細(xì)胞粘附分子Ⅰ及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響［J］. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2008，2(5):329-335.

［3］ 鮑建才，劉 剛，叢登立，等. 三七的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］. 中成藥，2006，28(2):246-253.

［4］ 陳 磊，陸 茵，鄭仕中. 丹參藥理活性成分的整合效應(yīng)［J］. 中草藥，2009，40(3):476-479.

［5］ 冀蘭鑫，黃 浩，李長志，等. 赤芍藥理作用的研究進(jìn)展［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33(3):233-236.

［6］ 陳龍虎. 高效液相色譜法測定七寶美髯口服液中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量［J］. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(3):23-24.

［7］ 劉田云，楊曉靜，劉明華，等. 不同廠家復(fù)方丹參片中三七皂苷類成分含量測定及高效液相特征圖譜［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(19):1645-1647.

［8］ 王譽(yù)潔，劉胤敏，吳紅兵，等. HPLC 法測定復(fù)黃片中香蒲新苷［J］. 中草藥，2010，41(11):1813-1814.

［9］ 李捷瑋，金柔男，李 翔，等. 多種中成藥中芍藥苷的含量測定［J］. 藥物分析雜志，2009，29(9):1440-1443.

［10］ 李小妹，康志英，梁 詠，等. HPLC 測定中風(fēng)回春膠囊中丹酚酸B 的含量［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(13):122-124.

［11］ 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:148，332，164，11，71，11.

［12］ Wan J B，Lai C M，Li S P，et al. Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction［J］. J Pharm Biomed Anal，2006，41(1):274-279.

［13］ 張 鳳，楊 陽，孫連娜，等. 生首烏與制首烏中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定與品質(zhì)考察［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(14):1228-1229.

［14］ 段秀俊，裴妙榮，范書龍. HPLC 法測定雙參消銀膠囊中芍藥苷含量［J］. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4 (3):173-174.

［15］ 賴宇紅，陳浩桉，區(qū)卓瑩，等. 三七總皂苷指紋圖譜及含量測定HPLC 條件的耐用性考察［J］. 中國天然藥物，2006，4(2):107-110.