二苯乙烯苷上調SIRT1 蛋白防治心肌缺血再灌注損傷*

甘受益，李彩蓉，2＊＊，曾令勇，黃紅霞，鎮(zhèn)海濤，2，馮光瑞

(1.咸寧市中心醫(yī)院心血管內科，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院臨床醫(yī)學院)

急性心肌缺血是指急性冠狀動脈閉塞，血流中斷所致的心肌局部缺血性壞死，藥物溶栓、經皮冠狀動脈成形術及冠脈搭橋術等方法可及時恢復血供，改善心肌缺血。但研究［1］也發(fā)現(xiàn)恢復心肌血供在短時間內可加重原有的缺血性心肌損傷，還可導致心律失常、心力衰竭等更嚴重的損傷，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。尋找減輕MIRI 的藥物對治療急性心肌缺血、提高預后具有重要的意義。SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)是一種具有NAD2依賴的蛋白去乙酰化酶活性的多功能轉錄調節(jié)因子，在體內參與調控哺乳動物細胞壽命的不同信號通路、糖代謝及胰島素分泌等。最近研究［2］發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注損傷，提示SIRT1 在心肌損傷中起重要作用。中藥何首烏屬是多年生落葉藤本蓼科藥用植物，具有多種保健和醫(yī)藥功能，二苯乙烯苷(TSG)是其最主要的活性成分之一，具有增強免疫力、抗衰老、抗氧化等多種生物學效應［3，4］，并且是SIRT1 最重要的激活劑之一，提示TSG 可能通過調節(jié)SIRT1 從而對MIRI 有防治作用。本研究采用結扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法建立MIRI 模型，再灌注前預先給予TSG，觀察其是否通過調節(jié)SIRT1 從而對抗MIRI。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

TSG(北京中國藥品生物制品鑒定所，純度98%，批號Z080912-3)，SOD、GSH-Px 和MDA 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);SIRT1、βactin 抗體(Santa Crtz，USA)。

1.2 動物

清潔級近交系雄性SD 大鼠(由湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)，體質量(220 ±14)g，每籠5 只，飼養(yǎng)于標準環(huán)境，12h 光照周期。

1.3 儀器

DH2140B 型動物人工呼吸機(浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器廠);RM6240 生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制備與處理

大鼠腹腔注射10%烏拉坦(4ml/kg)麻醉，氣管切開并使用呼吸機通氣。分離右側頸總動脈，連接至RM6240 生物信號處理系統(tǒng)，記錄左心室內壓(LVSP)、左心室內壓最大變化速率(±dp/dtmax)以及左心室舒張末期壓力(LVEDP)，并同時記錄肢體導聯(lián)心電圖。暴露心臟，用穿有聚氯乙烯管的手術線結扎冠狀動脈左前降支，結扎30 min 后恢復血流灌注120 min 后結束實驗。結扎后心電圖出現(xiàn)ST 段抬高、QRS 波增寬或振幅加大表示模型成功。給藥方式為結扎30min 后恢復血流前舌下靜脈注射。實驗分為假手術組，缺血再灌注組，缺血再灌注+TSG(10mg/kg)組及缺血再灌注+TSG(20mg/kg)組。

1.4.2 心肌組織組織病理學檢測

福爾馬林固定心臟，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察心肌的形態(tài)學變化。

1.4.3 心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性、丙二醛(MDA)含量測定

操作按試劑盒(南京建成)說明書進行。

1.4.4 心肌組織SIRT1 表達檢測

提取心肌總蛋白，以Western Blot 檢測SIRT1表達，顯影條帶用圖像分析系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TSG 對缺血再灌注大鼠心功能的影響

缺血再灌注120 min 后大鼠LVSP 及±dp/dtmax 逐漸下降，而LVEDP 則進行性增加，表明大鼠心功能明顯受損。TSG 治療組與缺血再灌注組相比，大鼠LVSP 及±dp/dtmax 均有相應增加，而LVEDP 明顯降低，表明TSG 對缺血再灌注所致的心功能損害具有一定防治作用，見表1。

表1 TSG 對大鼠心功能的影響(，n=10)

表1 TSG 對大鼠心功能的影響(，n=10)

與假手術組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

2.2 TSG 對缺血再灌注大鼠心肌形態(tài)學的影響

HE 染色光鏡下顯示假手術組心肌細胞排列規(guī)整，染色均勻，胞核清晰可見，無炎性反應，缺血再灌注120 min 后心肌細胞排列混亂，染色深淺不一，心肌纖維萎縮，局部有灶性溶解壞死，間質可見炎性細胞浸潤;TSG 治療組心肌細胞排列較整齊，胞核較清晰，胞漿有部分空泡樣變性，間質無炎性細胞，以大劑量TSG 治療組效果更明顯。

2.3 TSG 對缺血再灌注大鼠心肌SOD 和GSH 的活性、MDA 含量的影響

與假手術組相比，缺血再灌注大鼠心臟組織均漿中SOD 和GSH 活性明顯降低(P ＜0.01)，MDA 含量顯著上升(P ＜0.01)。TSG 治療組能夠增加心臟組織SOD 和GSH 活性，并且減少MDA的生成。提示TSG 可通過增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心臟過度的脂質過氧化反應而起到心臟保護作用，見表2。

表2 TSG 對心肌組織SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影響(，n=10)

表2 TSG 對心肌組織SOD 和GSH-Px 的活性、MDA 含量的影響(，n=10)

與假手術組比較，* P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P ＜0.05

2.4 TSG 對缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達的影響

Western blot 結果顯示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達下降，與假手術相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，TSG 治療后心肌組織SIRT1 蛋白表達量上升，提示TSG 可能通過上調心臟SIRT1 蛋白水平而對心肌再灌注損傷有防治作用，見圖1。

圖1 TSG 對缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達的影響

3 討論

心肌血液供應以及新陳代謝是保證心臟正常功能的重要條件，心肌缺氧缺血會引起細胞結構性損傷，及時恢復缺血心肌的血液供應是治療急性心肌缺血的重要原則。但大多數情況下心肌缺血再灌注后都會有一定的損傷，出現(xiàn)明顯的功能障礙。我們采用手術線結扎冠狀動脈左前降支后再松開的方式復制臨床上常見的心肌缺血再灌注損傷的模型，結果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注120 min 后大鼠心功能明顯受損;心肌細胞排列混亂，染色深淺不一，心肌纖維萎縮，局部有灶性溶解壞死，間質可見炎性細胞浸潤。TSG 治療組結果顯示TSG 能增加LVSP 及±dp/dtmax 及減少LVEDP，并且心肌組織結構發(fā)生明顯改善，提示TSG 能防治缺血再灌注引起的心功能損害及心肌組織損傷。

目前研究認為缺血再灌注損傷的主要機理是細胞內的鈣超載及氧自由基的產生增多所致。心肌缺血再灌注時，線粒體功能障礙，氧化酶活性降低，同時SOD、GSH 等還原酶的活性降低，清除活性氧的能力減弱，產生大量氧自由基。增加的氧自由基與細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，使得其過氧化產物MDA 含量增多，MDA 能破壞細胞膜導致細胞損傷。我們的結果顯示TSG 可增加心臟組織SOD 和GSH-Px 活性，并且減少MDA 的生成，提示TSG 可通過增加心肌抗氧化酶的活性及抑制心臟脂質過氧化反應而起到心臟保護作用。

SIRT1 在哺乳動物組織中廣泛表達，在機體的能量調控中起重要作用［5］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TSG 能夠通過上調腎臟SIRT1 蛋白的表達增強腎臟抗氧化能力而對糖尿病腎病有防治作用［6］，最近有研究發(fā)現(xiàn)敲除SIRT1 可加重小鼠心肌缺血再灌注損傷［2］。我們的實驗顯示缺血再灌注大鼠心肌SIRT1 表達明顯下降，TSG 治療組心肌組織SIRT1 表達明顯上升，由于SIRT1 在能量調控中起重要作用，提示TSG 可能通過上調心臟SIRT1蛋白水平增強心肌的抗氧化能力而對心肌再灌注損傷有防治作用。

［1］Wu ZK，Iivainen T，Pehkonen E，et al.Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization［J］.Circulation，2002，106(24):3091

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［4］李彩蓉，蔡飛，黎榮，等.二苯乙烯苷對糖尿病大鼠腎小球系膜細胞增殖及分泌炎癥因子的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，26(2):13

［5］Lavu S，Boss O，Elliott PJ，et al.Sirtuins-novel therapeutic targets to treat age-associated diseases［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8(6):516

［6］Li C，Cai F，Yang Y，et al.Tetrahydroxystilbene glucoside ameliorates diabetic nephropathy in rats:involvement of SIRT1 and TGF-β1 pathway［J］.Eur J Pharmacol，2010，649(1-3):382