熒光分光光度法測定大山楂丸中黃酮類化合物的含量Δ

王海燕，賈寶秀，臧晴晴（1.泰安市食品藥品檢驗中心，山東泰安 71000；.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安71016）

大山楂丸由山楂、神曲、麥芽組成，是開胃消食的常用中成藥。在臨床上廣泛用于治療食欲不振、消化不良、脘腹脹滿等。其主要的化學(xué)成分包括多種黃酮類化合物、有機(jī)酸、維生素及各種消化酶等。目前，測定黃酮類成分的方法主要有薄層色譜法［1］、高效液相色譜法［2］、紫外分光光度法［3-4］等。熒光分析法自20 世紀(jì)70 年代起以其高靈敏度、選擇性好、樣品需用量少、重現(xiàn)性好、儀器設(shè)備簡單不昂貴等特點，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、材料及藥物、毒物的分析［5-12］。熒光分析法主要包括直接測定法和衍生化法。其中，衍生化法是由于藥物自身無熒光或者在水溶液中的熒光強(qiáng)度低，無法直接測定，必須通過加入其他試劑來提高藥物的熒光強(qiáng)度而建立的熒光分析法。

槲皮素屬黃酮類代表化合物之一，本身有比較弱的熒光，但加入鋁離子后，熒光發(fā)射波長發(fā)生了明顯的紅移，熒光強(qiáng)度得到很大的提高；通過紫外光譜法進(jìn)一步證明二者形成了配位化合物。在此基礎(chǔ)上，筆者建立了一種新的測定大山楂丸中黃酮類含量的熒光分光光度法，成功用于大山楂丸中總黃酮的含量測定，并且將測定結(jié)果與《中國藥典》比色法進(jìn)行比較，為大山楂丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

熒光分光光度計（日本島津設(shè)備公司，型號：RF-5301PC）；紫外可見分光光度計（上海亞榮生化儀器廠，型號：sp-752）；電子天平（上海恒豐科學(xué)儀器有限公司，型號：MP300D）。

1.2 藥品與試劑

大山楂丸（市售品，北京同仁堂股份有限公司）；槲皮素（中國食品藥品檢定研究院）；乙醇、鹽酸、三氯化鋁等試劑除另有說明外均為分析純，水為二次去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗方法

2.1.1 熒光光譜及熒光強(qiáng)度的測定。于10 ml 比色管中依次加入鹽酸（0.01 mol/L）1.0 ml、一定量鋁離子（Al3+）溶液，再加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試品溶液，用水定容至10 ml。設(shè)定熒光激發(fā)/發(fā)射波長為281/352 nm、激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度為5 nm，在300～500 nm波長范圍內(nèi)記錄熒光光譜及熒光強(qiáng)度。

2.1.2 總黃酮的提取。取市售大山楂丸，切成小塊，于120 ℃干燥2 h，精密稱取適量，置于索氏提取器中，用95%的乙醇溶液125 ml回流提取1.5 h，將提取液轉(zhuǎn)移至250 ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻即得供試品溶液。

2.2 試驗結(jié)果

2.2.1 體系的熒光光譜圖。按照試驗方法，掃描得到了有/無鋁離子存在體系的熒光激發(fā)和發(fā)射譜圖，見圖1。

由圖1 可以看出，在無鋁離子存在的體系中，槲皮素的熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為274、347 nm；當(dāng)體系加入鋁離子后，在347 nm處的熒光峰減弱，而在437 nm處出現(xiàn)一個新的熒光峰，說明槲皮素和鋁離子形成了絡(luò)合物，共軛程度增大，熒光峰發(fā)生了紅移。

圖1 熒光化合物的熒光激發(fā)及發(fā)射光譜a、b.槲皮素的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜（無鋁離子體系）；c、d.槲皮素-鋁絡(luò)合物的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Fig 1 Fluorescence excitation/emission spectra of fluorescent chemicals a-b：spectra of quercetin（without aluminum ion）；c-d.spectra of quercetin-aluminum complex compound

2.2.2 試驗條件的優(yōu)化。本文考察了酸度（鹽酸用量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 ml，見圖2）、表面活性劑［曲拉通X-100（Triton X-100）、十二烷基磺酸鈉（SLS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、β-環(huán)糊精（β-CD）（濃度均為1%）］、溫度（室溫25 ℃，水浴33、53、73 ℃）、反應(yīng)時間（20、40、60、80、100 min）及鋁離子濃度（1×10-4、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4、6×10-4、7×10-4、8×10-4、9×10-4、10×10-4mol/L，見圖3）對體系熒光強(qiáng)度的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鹽酸酸性介質(zhì)中、無表面活性劑、常溫下、反應(yīng)30 min、鋁離子濃度為2×10-4mol/L時，體系的熒光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定。

圖2 熒光強(qiáng)度隨鹽酸用量變化Fig 2 Fluorescence intensity in relation to hydrochloric acid volume

圖3 熒光強(qiáng)度隨鋁離子濃度變化曲線Fig 3 Curves of fluorescence intensity in relation to aluminum ion concentration

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。通過對試驗條件的優(yōu)化，確定了最佳試驗條件，按此條件配制一系列不同濃度的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗方法測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素濃度（c）在0.2×10-5～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度（F）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F＝500.57c-8.276 7（r＝0.995 8）。對濃度為1.0×10-5mol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11 次平行測定，RSD 為0.80%；根據(jù)國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）規(guī)定，cL＝KS0/S，其中cL為檢測下限，K為與置信水平相關(guān)的常數(shù)，S0為11次空白溶液測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S0＝0.42），S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，結(jié)果測得檢測限為2.4×10-8mol/L。

2.2.4 加樣回收率測定。為驗證所建立分析方法的準(zhǔn)確度，分別移取已知含量的樣品溶液3份，分別加入不同體積的對照品溶液，進(jìn)行加樣回收試驗，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，利用該方法測定大山楂丸中總黃酮的含量，回收率在96%～104%之間，表明本方法準(zhǔn)確度較好。

表1 回收率測定結(jié)果Tab 1 Determination results of recovery rate

2.2.5 樣品測定。依據(jù)“2.1.2”項下樣品處理方法提取了市售不同批號的大山楂丸中黃酮類成分，按上述試驗方法測定總黃酮的含量，并與《中國藥典》規(guī)定的比色法測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果令人滿意，見表2。

表2 樣品測定結(jié)果Tab 2 Determination results of samples

3 討論

3.1 酸度的影響

當(dāng)溶液體系在酸性條件下時，鋁離子與槲皮素的絡(luò)合作用更強(qiáng)，所以本體系選擇在鹽酸酸性介質(zhì)下進(jìn)行測定。酸性的強(qiáng)弱對體系的熒光影響較為顯著，筆者考察了加入不同體積的鹽酸溶液對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入鹽酸的體積為1 ml時，熒光強(qiáng)度最大且比較穩(wěn)定，因此選擇鹽酸的加入體積為1 ml。

3.2 表面活性劑的影響

表面活性劑具有增溶增敏的作用。筆者考察了5 種不同的表面活性劑（Triton X-100、SLS、SDS、CTAB、β-CD）對槲皮素-鋁絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入表面活性劑前后，體系的熒光強(qiáng)度沒有明顯的增強(qiáng)，故本試驗中選擇不加表面活性劑。

3.3 溫度的影響

溫度是影響熒光強(qiáng)度的一個重要的因素。筆者考察了不同溫度（25、33、53、73 ℃）對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，體系熒光強(qiáng)度顯著降低，初步判斷應(yīng)該是發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，因此選擇在室溫下進(jìn)行測定。

3.4 反應(yīng)時間的影響

筆者考察了不同反應(yīng)時間（20、40、60、80、100 min）對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體系熒光強(qiáng)度在20～40 min 內(nèi)最高且基本保持穩(wěn)定；在40 min之后，熒光強(qiáng)度呈緩慢下降趨勢，因此選擇放置30 min后進(jìn)行測定。

3.5 鋁離子濃度的影響

鋁離子的濃度直接影響絡(luò)合反應(yīng)的完全程度，從而影響體系熒光強(qiáng)度。筆者考察了不同濃度鋁離子對體系熒光強(qiáng)度的影響，如圖3所示，隨著鋁離子濃度的增大，熒光強(qiáng)度隨之增加。當(dāng)鋁離子濃度為2×10-4mol/L，體系的熒光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，故選擇鋁離子濃度為2×10-4mol/L。

綜上，鋁離子的加入，可使槲皮素的熒光發(fā)射光譜發(fā)生較大的紅移，且熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，以鋁離子作為絡(luò)合試劑，通過優(yōu)化試驗條件，建立了一種新的測定總黃酮含量的熒光分光光度法，成功用于大山楂丸中總黃酮的測定，與《中國藥典》規(guī)定的比色法相比，靈敏度大大提高。本研究可為活性成分為黃酮類化合物的中藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

［1］ 王光忠，李橋，宋恬，等.復(fù)方腦得生中黃酮類成分的高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（8）：1907-1908.

［2］ 郭亞健，范莉，王曉強(qiáng)，等.關(guān)于NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討［J］.藥物分析雜志，2002，22（2）：97-99.

［3］ 岐琳，牛曉峰.小飛蓬中總黃酮的含量測定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32（8）：1088-1089.

［4］ 張敏，曹庸，唐純翼，等.Al3+-蘆丁二元絡(luò)合物熒光光度法測定銀杏葉中總黃酮的含量［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2005，21（2）：188-189.

［5］ 謝軍.熒光分光光度法對馬波沙星含量的測定［J］.分析試驗室，2012，31（7）：94-96.

［6］ 陶慧林，黎舒懷，徐銘澤，等.熒光猝滅法測定中草藥中痕量鈷［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2013，49（4）：413-416.

［7］ 周尚，楊季冬，賀奎娟，等.熒光光譜法測定食品中蘇丹紅含量［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2013，49（2）：179-182.

［8］ 鄭元財，翁志良，張奕榮，等.熒光分光光度法檢測大鼠膀胱組織中表阿霉素濃度［J］.海峽藥學(xué)，2012，24（10）：37-40.

［9］ 朱燕舞，陳燕，姚昌中，等.同步導(dǎo)數(shù)熒光光譜法測定食品中3 種芳香族氨基酸［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2013，49（1）：1-5.

［10］ 龔蘭新，翁之望，喻雪菲.頭孢噻肟鈉與牛血清白蛋白的相互作用［J］.光譜實驗室，2013，30（1）：162-166.

［11］ 吳悠，楊甲甲，蔡元麗，等.熒光光譜法測定阿侖膦酸鈉含量［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2012，48（10）：1184-1186.

［12］ 王娜，于海洋，張曉輝，等.芥子堿與牛血清白蛋白的相互作用［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2012，28（6）：478-482.