唑來膦酸與紫杉醇體外協(xié)同抗肺腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制研究

劉 霞 張會來 周世勇 錢正子 王先火 王華慶

雙膦酸鹽是治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移常用的藥物。特別是ZOL治療骨轉(zhuǎn)移取得了極大成功。隨著對ZOL的研究，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)ZOL在體外能夠誘導(dǎo)肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［1］；并且ZOL聯(lián)合細(xì)胞毒藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用［2］。本實(shí)驗(yàn)擬研究ZOL對人肺腺癌A-549細(xì)胞體外生長增殖的作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

A-549細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院免疫室提供；ZOL由瑞士諾華公司贈送；合成基因所需引物及測序由大連寶生物工程公司完成；核酸提取試劑Trizol，實(shí)時定量熒光試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗人ERK多克隆抗體、兔抗人P-ERK多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、兔抗人P-AKT多克隆抗體、兔抗人P-Bcl-2多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 A-549細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)A-549，每天計(jì)數(shù)3個孔細(xì)胞數(shù)，繪制1周的生長曲線。

1.2.2 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) MTT方法測定不同濃度ZOL單藥（10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μM）與聯(lián)合PTX（2 nM）用藥后A-549生長情況。聯(lián)合用藥組根據(jù)給藥順序的不同分為先PTX后ZOL組、PTX+ZOL同時組、先ZOL后PTX組。MTT處理后，檢測吸光度值（OD）。計(jì)算各組抑制率，抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡分析 A-549接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，分組加藥，包括對照組、ZOL組（100 μM）、PTX組、先PTX后ZOL組、PTX+ZOL同時組、先ZOL后PTX組。藥物作用后，收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。判斷標(biāo)準(zhǔn)：正常細(xì)胞AnnexinⅤ（-），PI（-）；凋亡細(xì)胞AnnexinⅤ（+），PI（-）；壞死細(xì)胞AnnexinⅤ（+），PI（+）。重復(fù)3次，計(jì)算各組平均凋亡率，以±s表示。

1.2.4 RT-PCR檢測mRNA表達(dá) A-549接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，分組加藥，包括對照組、ZOL組（100 μM）、PTX組、先PTX后ZOL組。GenBank檢索ERK、AKT、β-actin的mRNA序列，采用PCR PRIMER計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)，最大程度保證擴(kuò)增特異性。擴(kuò)增ERK、AKT、β-actin。RT-PCR定量檢測mRNA表達(dá)?；虮磉_(dá)量計(jì)算方法：CT（cycle threshold）值代表擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。按公式計(jì)算樣本中mRNA相對表達(dá)量。ΔCT（目的基因）=CT（目的基因）-CT（β內(nèi)參）；ΔΔCT=ΔCT（目的基因）-ΔCT（標(biāo)準(zhǔn)值），目的基因相對表達(dá)量為 2-ΔΔCT。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) A-549接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，分組加藥，包括對照組、ZOL組（100 μM）、PTX組、先PTX后ZOL組。藥物作用后提取蛋白，進(jìn)行蛋白電泳，并行電轉(zhuǎn)移，PVDF膜取出，蛋白免疫檢測并顯影。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相記錄。Western blot顯示的蛋白條帶掃描后采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和吸光度值，采用兩組吸光度值/內(nèi)參吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性選用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A-549細(xì)胞生長特點(diǎn)

通過繪制1周的生長曲線，A-549細(xì)胞孵育1 d后進(jìn)入對數(shù)生長期，此時細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度ZOL對A-549細(xì)胞生長抑制作用

ZOL為10～100 μM對A-549均有抑制作用，并隨著ZOL濃度增加而增強(qiáng)。結(jié)合國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)用藥濃度［3］及臨床血藥濃度分布特點(diǎn)，選擇100μM為ZOL聯(lián)合用藥濃度。

2.3 不同給藥組對A-549細(xì)胞生長抑制作用

ZOL+PTX同時組細(xì)胞抑制率較單藥組增高（表1）。ZOL與PTX具有協(xié)同增效作用。在3個聯(lián)合用藥組中，先PTX后ZOL組抑制率最大，其次為ZOL與PTX同時組，而先ZOL后PTX組抑制率最小。不同順序聯(lián)合用藥組抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.07，P＜0.01），3組抑制率兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 不同給藥組對A-549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用

單藥組細(xì)胞凋亡率較對照組高（表2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 545，P＜0.01）；用藥組兩兩比較時，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組間比較時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率大小與給藥順序有關(guān)。

2.5 RT-PCR結(jié)果

先PTX后ZOL組的AKT基因表達(dá)量低于PTX、ZOL和空白對照組（表3），且先PTX后ZOL組與其他3個組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=568，P＜0.05）。

先PTX后ZOL組的ERK基因表達(dá)量低于PTX、ZOL和空白對照組（表4），且先PTX后ZOL組與其他3個組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=532，P＜0.05）。

表1 ZOL、PTX單藥，ZOL與PTX聯(lián)合用藥對A-549抑制率（±s）Table1 Inhibition rate of ZOL alone,PTX alone,or combined treatment with ZOL and PTX in A-549 cells （±s）

表1 ZOL、PTX單藥，ZOL與PTX聯(lián)合用藥對A-549抑制率（±s）Table1 Inhibition rate of ZOL alone,PTX alone,or combined treatment with ZOL and PTX in A-549 cells （±s）

Experimental group PTX（2 nM）ZOL（100 μM）ZOL and PTX together PTX then ZOL ZOL then PTX Inhibition rate（%）12.07±0.70 27.81±1.38 41.96±3.29 46.57±3.30 37.66±0.36

表2 ZOL、PTX單藥，ZOL與PTX聯(lián)合用藥對A-549凋亡率（±s）Table2 Apoptotic rate of ZOL alone，PTX alone，or combined treatment in A-549 cells （±s）

表2 ZOL、PTX單藥，ZOL與PTX聯(lián)合用藥對A-549凋亡率（±s）Table2 Apoptotic rate of ZOL alone，PTX alone，or combined treatment in A-549 cells （±s）

Experimental group Control PTX （2 nM）ZOL（100 μM）ZOL and PTX together PTX then ZOL ZOL then PTX Apoptotic rate（%）5.80±0.36 7.30±0.44 12.23±0.60 33.13±0.55 37.97±0.60 31.60±0.70

表3 A-549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中AKT基因mRNA表達(dá)量Table3 mRNA expression of AKT after different treatments for A-549 cells

表4 A-549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中ERK基因mRNA表達(dá)量Table4 mRNA expression of ERK after different treatments for A-549 cells

2.6 Western blot檢測各組細(xì)胞ERK、P-ERK、AKT、P-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果示：空白組、ZOL組、PTX組、先PTX后ZOL組細(xì)胞ERK、AKT蛋白表達(dá)水平均無差異，但ERK和AKT磷酸化水平為空白組最高，ZOL組次之，再次為PTX組，先PTX后ZOL組最低（圖1、2）。Bcl-2蛋白表達(dá)為空白組最高，ZOL組次之，再次為PTX組，先PTX后ZOL組最低（圖3）。

圖1 A-549細(xì)胞中AKT和P-AKT蛋白表達(dá)Figure1 AKT and P-AKT protein levels in A-549 cells

圖2 A-549細(xì)胞中ERK和P-ERK蛋白表達(dá)Figure2 ERK and P-ERK protein levels in A-549 cells

圖3 A-549細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)Figure3 Bcl-2 protein level in A-549 cells

3 討論

ZOL系第3代含氮雜環(huán)雙膦酸鹽，對多種實(shí)體瘤引起的骨轉(zhuǎn)移均有效，與前2代雙膦酸鹽相比，具有起效更快、緩解率更高、緩解時間更長等特點(diǎn)［4］。當(dāng)前藥物臨床前研究提示ZOL除了對骨吸收有抑制作用外，還有直接的體內(nèi)外抗腫瘤作用［5］，并且與數(shù)種細(xì)胞毒藥物聯(lián)合具有協(xié)同增效的作用［6-7］。為此本研究設(shè)計(jì)了ZOL與PTX體外協(xié)同抗肺腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制研究。

本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示10～100 μM不同濃度ZOL及2 nM PTX對A-549均有抑制作用，ZOL抑制作用具有濃度依賴性。ZOL與PTX聯(lián)合應(yīng)用時抑制作用優(yōu)于ZOL或PTX單藥。兩藥聯(lián)合使用時，抑制作用大小與給藥順序有關(guān)。由大到小對應(yīng)組為：先PTX后ZOL＞PTX+ZOL同時＞先ZOL后PTX。

流式細(xì)胞儀檢測凋亡發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組凋亡率亦同PTX、ZOL給藥順序有關(guān)，說明ZOL與PTX聯(lián)合應(yīng)用抑制細(xì)胞生長作用機(jī)制之一為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞生長、凋亡密切相關(guān)［8］。細(xì)胞內(nèi)促生存蛋白AKT的磷酸化（phosphorylated AKT，P-AKT）在癌細(xì)胞發(fā)生中起重要作用［9］。AKT活性形式的表達(dá)能阻止凋亡的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移［10］。AKT磷酸化激活后，對下游蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終抑制細(xì)胞凋亡，其抗凋亡作用可能與調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員活性有關(guān)。Bcl-2家族成員分為凋亡抑制蛋白和促凋亡蛋白2類，Bcl-2、Bcl-xL等屬于凋亡抑制蛋白，Bax、Bad等屬于促凋亡蛋白。AKT的激活使Bad的Ser136/Ser112殘基磷酸化，磷酸化的Bad與Bcl-2或Bcl-xL解聚，游離的Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用［11］。AKT作為蛋白激酶，磷酸化后才發(fā)揮生物活性，因此，P-AKT是代表此蛋白激酶活性的指標(biāo)。

RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活首先是RAS活化，活化的RAS與絲/蘇氨酸蛋白激酶（RAF-1）結(jié)合，激活RAF-1，進(jìn)而激活MEK，最終導(dǎo)致ERK1/2的激活?；罨腅RK1/2可磷酸化其他胞漿蛋白或從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核促進(jìn)多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，如c-Jun、c-Fos和ELK-1等，從而調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化［12］。

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示：A-549細(xì)胞中ERK和AKT的mRNA表達(dá)均為空白組最高，ZOL組次之，再次為PTX組，先PTX后ZOL組最低。在本實(shí)驗(yàn)條件下，ZOL聯(lián)合PTX可能通過下調(diào)RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路中ERK和AKT基因mRNA的表達(dá)，從而抑制A-549細(xì)胞的生長增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

Western blot顯示：各實(shí)驗(yàn)組ERK和AKT蛋白表達(dá)水平均無差異，但AKT和ERK磷酸化水平為空白組最高，ZOL組次之，再次為PTX組，先PTX后ZOL組最低。Bcl-2蛋白表達(dá)亦是如此。這進(jìn)一步證實(shí)ZOL聯(lián)合PTX可能通過抑制RAF/MEK/ERK信號通路中ERK磷酸化水平，降低ERK活性，進(jìn)而抑制A-549細(xì)胞生長和增殖，同時也通過抑制PI3K/AKT信號通路中的AKT磷酸化水平，進(jìn)一步降低Bcl-2水平，起到促凋亡作用。ERK和AKT是ZOL聯(lián)合PTX抑制A-549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的兩個重要靶點(diǎn)。

綜上所述，ZOL、PTX對A-549細(xì)胞均有抑制作用，且ZOL抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。ZOL與PTX聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，該作用具有給藥順序依賴性，抑制率最大的給藥順序?yàn)橄萈TX后ZOL。根據(jù)分子水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ZOL聯(lián)合PTX可能通過下調(diào)RAF/MEK/ERK中ERK基因的mRNA表達(dá)，降低ERK磷酸化水平，抑制ERK激酶的活性，進(jìn)而抑制A-549細(xì)胞生長增殖。此外，還可能通過下調(diào)PI3K/AKT中AKT基因的mRNA表達(dá)，降低AKT磷酸化水平，進(jìn)而減弱AKT活性，進(jìn)一步降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平，起到促凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論僅限于細(xì)胞水平，尚需在動物模型上進(jìn)一步研究。此外，研究顯示ZOL還可抑制腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲及血管的生成［13］，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接的發(fā)揮抗腫瘤作用，其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。

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