光子晶體編碼液相芯片技術(shù)與腫瘤篩查*

楊子學(xué) 陳寶安 顧忠澤

惡性腫瘤已成為發(fā)展中國(guó)家的首位死因及發(fā)達(dá)國(guó)家的第二死因，早期篩查、早期診斷和早期治療是提高治愈率的關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是惡性腫瘤早期篩查的重要組成部分，尤其是多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷率。然而，目前臨床上此類檢測(cè)大多采用單指標(biāo)方法，若應(yīng)用于腫瘤篩查，不僅成本高，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不易推廣［1］。

液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一種多元分析技術(shù)，具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新一代的腫瘤篩查方法［2］。液相芯片由編碼微球、探針分子、目標(biāo)分子和報(bào)告分子四部分組成。商用的編碼微球主要通過熒光進(jìn)行編碼，但該編碼方式存在熒光易淬滅而導(dǎo)致的編碼丟失或誤編碼等問題。2002年Cunin等［3］開發(fā)了多孔硅光子晶體薄膜編碼載體；2006年Zhao等［4-5］制備出了自組裝光子晶體微球。這些研究工作使光子晶體成為一種新的編碼方式。該編碼方式不僅解決了液相芯片中載體編碼的穩(wěn)定性問題，而且由于其熒光背景低，提升了檢測(cè)靈敏度。光子晶體編碼液相芯片已逐漸在腫瘤標(biāo)志物分析中嶄露頭角。

1 基于光子晶體編碼微球的液相芯片技術(shù)

液相芯片的四個(gè)組成部分中，編碼微球是核心技術(shù)。目前常見的編碼方式有光學(xué)編碼、圖形編碼、物理編碼、化學(xué)編碼等［6］。其中光學(xué)編碼最受關(guān)注，包含熒光編碼、量子點(diǎn)編碼、光子晶體編碼等。本文介紹的光子晶體是一種由單分散納米粒子自組裝所形成的具有周期結(jié)構(gòu)的材料。這類材料的光學(xué)反射特性可以通過納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)制［7］。光子晶體編碼可以通過兩種方式進(jìn)行解碼，分別是依靠裸眼的顏色識(shí)別以及利用光譜儀的反射峰檢測(cè)。前者不需儀器即可進(jìn)行多元分析，簡(jiǎn)單方便，而后者則可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

探針分子在微球表面的連接數(shù)量及穩(wěn)定性直接關(guān)系到檢測(cè)方法的靈敏度與重復(fù)性。光子晶體微球表面連接探針分子的方法包括硅烷偶聯(lián)法（GPTMS法、APTES-戊二醛法）和碳二亞胺縮合法，這些方法具有穩(wěn)定性好，對(duì)探針分子活性影響小等優(yōu)點(diǎn)［8-12］。

1.1 蛋白腫瘤標(biāo)志物分析

血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)是目前最常用的腫瘤篩查方法，臨床多采用數(shù)種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的策略以提高檢出率。甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）以及多種糖類抗原都是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤的血清標(biāo)志物，其檢測(cè)方法的確立也是光子晶體編碼液相芯片的研究重點(diǎn)。

1.1.1 基于二氧化硅膠體晶體微球的標(biāo)記檢測(cè) 二氧化硅膠體晶體微球（Silica Colloidal Crystal Beads，SCCBs）是一種由單分散二氧化硅納米粒子自組裝而成的光子晶體微球（圖1）。目前，SCCBs主要采用玻璃微流體芯片進(jìn)行制作，該方法快速便捷，產(chǎn)量大，得到的微球尺寸均一，有益于提高檢測(cè)的重復(fù)性［13］。掃描電鏡（SEM）圖片顯示，微球的表面粗糙，故其比表面積比同尺寸的普通微球大，有利于提高檢測(cè)靈敏度［14］。目前，十?dāng)?shù)種特征峰位置均勻分布于可見光區(qū)的光子晶體微球已經(jīng)可以被制備，而且在保證良好球形度的前提下，微球的直徑可以控制在約40～300 μm（圖2）。實(shí)驗(yàn)中采用的微球直徑通常在180～250 μm。

圖1 A.SCCBs的SEM圖片；B.SCCBs表面細(xì)節(jié)的放大SEM圖片Table1 A.The SEM image of SCCBs；B.The enlarged image of surface details of SCCBs

圖2 SCCBs的光鏡照片和特征性反射峰［15］Table2 Light micrograph of the SCCBs and distinct reflection peak

標(biāo)記檢測(cè)是一種常規(guī)檢測(cè)方法，它利用不同的報(bào)告分子產(chǎn)生差異性檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)定量分析目標(biāo)分子的目的?；赟CCBs的標(biāo)記檢測(cè)主要采用熒光染料和酶辣根過氧化物酶（HRP）作為標(biāo)記物［8，11-12］；前者操作簡(jiǎn)便，使用的儀器也比較簡(jiǎn)單，但熒光易猝滅，需要避光操作；后者是化學(xué)發(fā)光方法的催化劑，可獲得比熒光方法更高的靈敏度，但對(duì)檢測(cè)儀器的要求較高。

采用基于SCCBs的熒光分析方法，AFP和CEA的檢測(cè)靈敏度可分別達(dá)到0.68 ng/mL和0.95 ng/mL［8］。然而，隨著熒光染料的更新?lián)Q代，其強(qiáng)度及穩(wěn)定性都不斷提高，熒光分析法的檢測(cè)靈敏度也將會(huì)進(jìn)一步提升。

Pei等［11］建立了基于SCCBs的化學(xué)發(fā)光分析方法，相比于熒光分析方法，該方法具有更高的靈敏度，AFP和CEA的檢測(cè)限可分別達(dá)到0.16 ng/mL和0.12 ng/mL，同時(shí)完成了25例臨床血清樣本的檢測(cè)，將所得結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光參考方法的結(jié)果進(jìn)行了比較。數(shù)據(jù)顯示兩種方法的結(jié)果沒有明顯差異，驗(yàn)證了基于SCCBs化學(xué)發(fā)光分析方法的準(zhǔn)確性。

1.1.2 基于硅水凝膠復(fù)合材料光子晶體微球的標(biāo)記檢測(cè) SCCBs可以通過微流控技術(shù)量產(chǎn)，是產(chǎn)業(yè)化光子晶體編碼液相芯片的首選載體。但在高靈敏度蛋白檢測(cè)中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SCCBs的孔隙結(jié)構(gòu)使得非特異性吸附明顯增多，需要增加洗滌強(qiáng)度和時(shí)間以去除，使實(shí)驗(yàn)過程繁瑣。Yang等［9］采用聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEG-DA）水凝膠填充SCCBs孔隙結(jié)構(gòu)的方法降低非特異性吸附，同時(shí)引入羧基功能基團(tuán)連接蛋白抗體，縮短了微球前處理時(shí)間，并避免了接觸芳香族試劑，明顯提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性，同時(shí)檢測(cè)靈敏度也能夠滿足AFP和CEA的檢測(cè)要求。

1.1.3 基于反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體微球的非標(biāo)記檢測(cè) 反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體微球是以SCCBs為模版，在二氧化硅納米粒子間隙填充高折射率的水凝膠材料后，除去模版所得到的光子晶體微球，結(jié)構(gòu)如圖3所示［7］。光子晶體微球的特征性反射峰位置與其微球體系內(nèi)部物質(zhì)的平均折射率相關(guān)，當(dāng)其內(nèi)部成分發(fā)生改變時(shí)，特征性反射峰位置也隨之變化。利用這一特性可實(shí)現(xiàn)基于反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體微球的非標(biāo)記檢測(cè)。Zhao等［16］將生物分子分散在水凝膠中，填充SCCBs后將模版去除，留下特殊結(jié)構(gòu)的空隙（圖4）。這些空隙只接受相同或具有類似空間結(jié)構(gòu)的生物分子進(jìn)入，使微球的反射峰發(fā)生紅移，根據(jù)波峰的移動(dòng)量即可確定目標(biāo)分子的含量（圖5）。這種分子印跡方法在腫瘤標(biāo)志物多元檢測(cè)中具有穩(wěn)定性好、載體易于保存的優(yōu)點(diǎn)。

圖3 A.反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球的SEM照片；B.反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球表面細(xì)節(jié)的放大SEM照片［17］Table3 A.SEM micrograph of the inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel；B.Magnified image of the surface details of the inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel

圖4 可用于非標(biāo)記分析的反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠微球的制作方法［16］Table4 Preparation of inverse opal structure photonic crystal microspheres in hydrogel used in the unlabeled analysis

圖5 隨著目標(biāo)物濃度的增大，水凝膠微球的反射峰逐漸紅移［16］Table5 Gradual red shifting of the reflection peak of hydrogel microspheres with increasing target object concentrations

除分子印跡法外，在水凝膠微球內(nèi)部連接抗體以捕捉目標(biāo)分子，也可改變平均折射率和反射峰位置，從而實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記檢測(cè)。Zhao等［17］利用這一方法實(shí)現(xiàn)了CA-199和CA-125兩種糖類抗原的多元分析，CA-199的最低檢出限為50 U/mL。

1.2 基因腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的腫瘤相關(guān)基因標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用?；诠庾泳w編碼微球的液相芯片技術(shù)不僅可用于蛋白質(zhì)標(biāo)志物多元分析，也可用于基因標(biāo)志物的多元分析。

1.2.1 基于SCCBs的標(biāo)記檢測(cè) 腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，多藥耐藥基因1（MDR1）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）是與腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)的兩個(gè)基因。Yang等［10］篩選確定了這兩個(gè)基因的特征性擴(kuò)增片段。這兩個(gè)片段具有相同的擴(kuò)增條件，可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中完成PCR擴(kuò)增，有利于同時(shí)分析兩個(gè)基因的表達(dá)情況。經(jīng)過擴(kuò)增的反應(yīng)液通過基于SCCBs的雙探針雜交實(shí)驗(yàn)可明確擴(kuò)增前的片段濃度。同時(shí)，K562和K562/A02細(xì)胞株的分析以及與熒光定量PCR方法的比對(duì)被用于驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可行性及準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，耐藥株細(xì)胞的MDR1的表達(dá)高于非耐藥株大約1 000倍，且兩種方法的結(jié)果較為一致。

1.2.2 基于反蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體微球的標(biāo)記檢測(cè) 相比于SCCBs，反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球具有更大的比表面積和更加疏松的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，有利于提高檢測(cè)靈敏度，去除非特異性吸附（圖3）。Zhao等［20］以反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球?yàn)檩d體，進(jìn)行DNA片段的標(biāo)記檢測(cè)。片段不經(jīng)擴(kuò)增，檢測(cè)限可以達(dá)到IE-12 M。然而，該方法在實(shí)際操作中不能獨(dú)立存在，須依賴于PCR擴(kuò)增技術(shù)。

2 光子晶體編碼技術(shù)的改進(jìn)

為了方便檢測(cè)，光子晶體的特征性反射峰一般落在可見光區(qū)域（350～770 nm）。所以在保證分辨率的情況下，編碼數(shù)量會(huì)受到限制，只能實(shí)現(xiàn)中低通量的生物分子檢測(cè)。如果要開展高通量的生物分子篩查，必須與其他的編碼方式結(jié)合，構(gòu)建聯(lián)合編碼，其中一種策略是將光子晶體編碼和量子點(diǎn)編碼進(jìn)行結(jié)合［21］。聯(lián)合編碼可極大地增加編碼數(shù)量，實(shí)現(xiàn)更高通量篩查。

3 展望

光子晶體編碼微球?yàn)橐合嘈酒夹g(shù)提供了穩(wěn)定的編碼，簡(jiǎn)易的解碼方式，為腫瘤篩查提供了靈活多變的多元分析技術(shù)，在腫瘤預(yù)防診斷工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。作為一種新興檢測(cè)技術(shù)，提高檢測(cè)的重復(fù)性，簡(jiǎn)化及規(guī)范化實(shí)驗(yàn)流程，是光子晶體編碼液相芯片亟待解決的問題。同時(shí)，針對(duì)一個(gè)具體問題，系統(tǒng)開展光子晶體編碼液相芯片的研制、應(yīng)用和驗(yàn)證工作，將有助于進(jìn)一步加快研究進(jìn)程，推動(dòng)這一新技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化。

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