腫瘤酸度活化的納米藥物載體

李洪軍 王 均

藥物治療仍然是腫瘤治療的主要手段之一，但面臨諸多挑戰(zhàn)［1］。1）藥物選擇性不強，導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)；2）對耐藥性腫瘤細胞無效；3）對轉(zhuǎn)移癌的療效差。開發(fā)安全有效的納米載體將藥物輸送到腫瘤［2-3］，有利于改變藥物的藥代動力學(xué)和生物體內(nèi)分布［4］，增強藥物的選擇性，提高其利用率。相對于傳統(tǒng)藥物基于納米載體的藥物具有以下優(yōu)勢［5］：1）對藥物有保護作用，可避免其被降解，并增加藥物的溶解性；2）阻止藥物與生物環(huán)境發(fā)生相互作用；3）延長藥物的血液循環(huán)時間，有助于藥物在腫瘤組織富集；4）增強細胞對藥物的攝?。?］。

目前約有250種基于納米載體的藥物進入臨床試驗階段，部分已用于臨床治療。但基于納米載體藥物的發(fā)展依受諸多限制，最主要是當(dāng)載體進入體內(nèi)后難以控制其藥物釋放行為，導(dǎo)致在腫瘤部位的藥物積累不足［7］。針對該難題，開發(fā)了新一代“智能型”納米藥物載體，可在外源性或內(nèi)源性的一些刺激條件下，通過改變其理化性質(zhì)提高藥物的輸送效率。常用的刺激因素包括pH變化、還原環(huán)境、酶環(huán)境、溫度和光等［8］；其中pH的變化應(yīng)用最為廣泛，主要是因為不同器官、組織以及細胞器具有不同的pH環(huán)境，可作為一種內(nèi)源性刺激因子，而不需借助外源性刺激［9］。

1 pHe激活的藥物釋放和pHe誘導(dǎo)的配體二次激活

腫瘤的酸性微環(huán)境是其一個顯著特征，利用pHe作為刺激因子提高納米載體的靶向效率，是一種重要治療策略［10］，兩種主要方式是藥物在腫瘤部位響應(yīng)性釋放和癌細胞對納米粒的攝取增加［11］。合理設(shè)計的納米?？稍谘h(huán)中保持穩(wěn)定，通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位累積，被pHe活化后，納米粒釋放藥物，或與癌細胞的相互作用增強使載體的攝取增加。圖1描述了3種不同的pHe活化的納米藥物載體系統(tǒng)［12-13］。

1.1 腫瘤pHe激活的藥物釋放

典型的pHe激活藥物載體系統(tǒng)是基于聚-L-組氨酸的pH敏感高分子膠束。聚-L-組氨酸上咪唑環(huán)的pKb約為6.5，能通過離子化使聚合物發(fā)生親疏水部分比例的轉(zhuǎn)變［14-16］。該研究發(fā)展了一種基于poly-His-b-PEG和（PLLA）-b-PEG特定比例的混合膠束，在pH＞7.4的條件下能夠保證顆粒在血液中的長循環(huán)以及包載藥物的不必要釋放、而當(dāng)pH＜7.0時，膠束內(nèi)部的polyHis離子化導(dǎo)致顆粒不穩(wěn)定，加速攜載藥物釋放。相比于非pH敏感對照組，該系統(tǒng)對腫瘤抑制效果顯著，腫瘤體積在50 d后僅增長到約為300 mm3，抑制效果接近80%。

1.2 pHe觸發(fā)的配體二次激活

另一種用于腫瘤酸度響應(yīng)的藥物輸送方式是通過pHe觸發(fā)的屏蔽/去屏蔽化轉(zhuǎn)換實現(xiàn)配體的二次激活。Bea等［8］研究組報道了基于pHe觸發(fā)的配體二次激活的多肽（TAT）修飾的膠束藥物載體系統(tǒng)。將細胞膜穿透肽TAT鍵合在PLLA-b-PEG的PEG末端并組裝成納米粒，證明在pH＞7.0條件下，TAT表面的正電荷與帶負電荷的聚甲基丙烯酰氯磺胺地托辛（PSD）和PEG嵌段共聚物（PSD-b-PEG）通過電荷相互作用結(jié)合，從而將TAT屏蔽，此時顆粒表面電勢為中性；當(dāng)pH降低到腫瘤酸度時，PSD去離子化，PSD-b-PEG保護層脫落，顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦圆⑶覍AT再次暴露在納米粒表面，從而增強癌細胞對納米粒的攝取能力。在細胞水平的實驗也驗證了在腫瘤酸度環(huán)境下屏蔽的膠束體系更容易被腫瘤細胞所攝取，從而增加治療效果［17］。

圖1 3種酸度活化的納米載體示意圖Figure1 Schematic diagram of three tumor extracellular pH environment（pHe）-activated nanocarriers

2 納米顆粒表面電荷反轉(zhuǎn)

上述基于pHe響應(yīng)的納米載體表現(xiàn)為癌細胞外藥物釋放，不利于殺傷耐藥細胞或運載核酸類藥物。表面帶正電荷的納米粒與細胞膜相互作用增強，有利于細胞攝取納米粒；但帶正電荷的納米粒很快與血液中的蛋白質(zhì)相互作用，使其在血循環(huán)中聚集被快速清除，難以到達靶部位。針對該難題的設(shè)計策略是，在正常生理條件下，納米粒在血循環(huán)中保持惰性，在實體瘤中通過滲透增強和滯留效應(yīng)（EPR）富集納米粒，進而被腫瘤pHe活化，表面轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?，增強與細胞膜的相互作用，提高細胞攝取和藥物療效［18-20］。

2.1 反轉(zhuǎn)納米粒表面電荷用于增強細胞攝取

Du等［21］最早設(shè)計了一種可在pHe下發(fā)生表面電荷反轉(zhuǎn)的納米凝膠PAMA-DMMA，其發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)后被細胞的攝取能力顯著增強。該研究先通過反向微乳液法制備了氨基官能化的納米凝膠，帶正電荷，然后用2，3-二甲基馬來酸酐（DMMA）對氨基進行修飾，獲得表面帶大量羧基的納米凝膠，帶負電荷；所形成的酰胺鍵在中性、堿性條件下穩(wěn)定，而在微酸性環(huán)境下則快速降解，重新暴露出氨基，使納米凝膠帶正電荷，從而增強腫瘤細胞對納米粒的攝?。▓D2）。

實驗證明，該納米凝膠在pH為7.4下呈負電性，幾乎不吸附牛血清白蛋白（BSA），提示有可能實現(xiàn)長循環(huán)并通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位富集，而在腫瘤pHe下，PAMA-DMMA納米粒在30 min內(nèi)迅速從負電性轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦?，人乳腺?dǎo)管癌細胞MDA-MB-435s的攝取量顯著增加。在體內(nèi)水平的實驗中，在原位注射到腫瘤部位后通過腫瘤組織切片觀察，PAMA-DMMA能夠有效進入腫瘤細胞并分散在胞漿內(nèi)；相反，不具備電位反轉(zhuǎn)能力的對照納米凝膠PAMA-SA則更多只是黏附在細胞膜上而不能有效進入細胞。

圖2 電荷反轉(zhuǎn)及非電荷反轉(zhuǎn)型納米膠PAMA-DMMA/PAMA-SA示意圖Figure2 Schematic diagram of the performances of drug-loaded pH-responsive charge-reversal PAMA-DMMA nanogels and non-charge-reversal PAMA-SA nanogels

2.2 反轉(zhuǎn)納米顆粒表面電荷用于增強對腫瘤干細胞（CSC）的殺傷

腫瘤干細胞是腫瘤復(fù)發(fā)的根源［22-23］，也是腫瘤耐藥的主因［24］。殺滅CSC是治療腫瘤的新策略［25］。為達此目標，納米載體需要被CSC大量攝取，且在胞內(nèi)有效釋放，大幅度提高胞內(nèi)有效藥物濃度。

Du等［26］設(shè)計了對兩種pH有序響應(yīng)的聚合物-阿霉素鍵合納米藥物（PPC-Hyd-DOX-DA），其中聚合物主鏈為PEG化的聚磷酸酯，聚磷酸酯的側(cè)基經(jīng)DMMA修飾，使納米藥物具有腫瘤酸度響應(yīng)性；同時，阿霉素分子也通過腙鍵鍵合到聚磷酸酯鏈段的側(cè)基，從而具有對內(nèi)涵體/溶酶體酸性的響應(yīng)性（圖3）。

結(jié)果表明，PPC-Hyd-DOX-DA納米藥物在pH為6.8時進入細胞的能力明顯高于pH為7.4時；進入細胞后，鍵合DOX的腙鍵在內(nèi)涵體pH（～5.0）中被破壞，使DOX從載體中釋放，進入細胞核中發(fā)揮抗癌作用。腫瘤干細胞球囊生長實驗顯示，PPC-Hyd-DOX-DA納米粒顯著抑制球囊生成。與之相比，只對單一酸度敏感的對照PPC-Hyd-DOX-SA（只對內(nèi)涵體/溶酶體酸度敏感）或PPC-Ami-DOX-DA（只對腫瘤酸度敏感），均不能有效抑制球囊生成。該研究提示，雙重pH敏感和反轉(zhuǎn)納米顆粒表面電荷的策略對耐藥性的腫瘤干細胞有明顯優(yōu)勢。

圖3 雙pH響應(yīng)的聚合物-阿霉素（DOX）鍵合藥物（PPC-Hyd-DOX-DA）結(jié)構(gòu)和pH觸發(fā)的增強細胞內(nèi)吞和胞內(nèi)藥物釋放示意圖Figure3 Chemical structure of the dual pH-responsive polymer-DOX conjugate（PPC-Hyd-DOX-DA）and schematic diagram of its pH-triggered cellular internalization and intracellular drug release

2.3 反轉(zhuǎn)納米粒表面電荷用于增強輸送小分子藥物到腫瘤的能力

兩性離子聚合物被認為是可能替代PEG的新材料，通常用于納米粒的親水部分延長其在體內(nèi)循環(huán)并更好地在腫瘤富集。但兩性離子納米粒與細胞膜相互作用較弱，致其難以被細胞攝取，從而限制其應(yīng)用。

Yuan等［27］設(shè)計了基于對腫瘤酸度敏感的兩親性嵌段聚合物PCL-b-P（AEP-g-TMA/DMA）納米粒，聚兩性離子結(jié)構(gòu)為納米粒的親水外殼。在血液pH值條件下，該納米粒表面電勢為中性，抗血液蛋白黏附力強，使其具有較長的血液循環(huán)時間。當(dāng)納米粒通過EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織后，微酸性環(huán)境使聚兩性離子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，納米粒的表面電勢迅速轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦?，從而增強細胞對納米粒攝取（圖4）。在與蛋白結(jié)合的模擬實驗中，該納米粒在pH為7.4的條件下基本不與蛋白結(jié)合，而在pH為6.8的條件下與蛋白的結(jié)合作用較強。體外和體內(nèi)實驗研究表明該納米粒在腫瘤微酸的環(huán)境下更容易被腫瘤細胞所攝取，而作為對照的非敏感的納米粒的內(nèi)吞能力則較弱。在動物水平的腫瘤抑制實驗也表明酸敏感兩性離子聚合物表面化的納米顆粒具有更強的腫瘤抑制作用。

圖4 基于pH響應(yīng)的表面電荷反轉(zhuǎn)兩性離子聚合物納米粒用于包載阿霉素示意圖Figure4 Schematic diagram of DOX-loaded zwitterionic polymer-based NPs and the changing of the surface-charge property in response to pHe

2.4 反轉(zhuǎn)納米粒表面電荷用于增強輸送siRNA到腫瘤的能力

siRNA有望成為重要的腫瘤治療策略［28-29］，但關(guān)鍵是如何有效將siRNA輸送到腫瘤組織并增強腫瘤細胞對siRNA的攝?。?0］。Yang等［31］使用二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺ssPEI800和siRNA形成帶正電的納米顆粒ssPEI800/siRNA，然后通過靜電作用將陰離子型聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段聚合物（PPC-DA）包覆到顆粒表面，形成表面PEG覆蓋的納米粒。PPC-DA在腫瘤微酸性環(huán)境下迅速降解，觸發(fā)高分子的電荷反轉(zhuǎn)，使高分子與ssPEI800/siRNA復(fù)合的納米?！懊摎ぁ?，重新暴露出帶正電荷的ssPEI800/siRNA顆粒，顯著增加腫瘤細胞的攝取，提高RNA干擾的效率（圖5）。在細胞水平和動物水平的實驗表明，具有酸度敏感的納米粒（S-NP）在腫瘤部位酸度條件下能夠更有效地被腫瘤細胞攝取并特異性沉默靶基因的表達，而腫瘤生長抑制實驗也表明S-NP能夠更加有效攜載siRNA對腫瘤進行治療。

3 展望

在過去的十年里，環(huán)境響應(yīng)性納米粒作為智能型藥物載體取得了顯著進展。本文重點介紹了幾種腫瘤酸度pHe響應(yīng)的納米載藥體系，這類體系在正常的生理條件下可保持穩(wěn)定，而在腫瘤部位的微酸性環(huán)境下發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，從而影響納米載體的性能，可以促進藥物的釋放，增強細胞對顆粒的攝取，減少藥物在其他組織器官中的分布等。

值得注意的是，雖然這種pHe響應(yīng)性納米載藥體系在用于腫瘤治療方面已經(jīng)取得了明顯的效果，但仍有許多問題需要解決。首先，需要對腫瘤微環(huán)境的物理化學(xué)和生物特性以及納米粒在腫瘤微環(huán)境中的變化進行更深入地研究；其次，基于響應(yīng)性納米載體給藥體系需要更多基于動物水平的獨立的研究，以及對藥物代謝動力學(xué)的更加深入地研究；再次，除了細胞攝取和胞內(nèi)藥物釋放之外，另外一個基于納米給藥體系的重要因素就是腫瘤滲透?？偠灾?，刺激響應(yīng)性材料為更加有效的靶向性腫瘤治療提供了新的機遇，并且刺激響應(yīng)性納米載體在腫瘤治療中也具有良好的應(yīng)用前景。

1 Gonzalez-Angulo AM,Morales-Vasquez F,Hortobagyi GN.Ov erview of resistance to systemic therapy in patients with breast cancer[J].Adv Exp Med Biol,2007,608:1-22.

2 Brindle K.New approaches for imaging tumour responses to treatment[J].Nat Rev Cancer,2008,8(2):94-107.

3 Szakács G,Paterson JK,Ludwig JA,et al.Targeting multidrug resistance in cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(3):219-234.

4 Allen TM,Cullis PR.Drug delivery systems:entering the mainstream[J].Science,2004,303(5665):1818-1822.

5 Kamaly N,Xiao ZY,Valencia PM,et al.Targeted polymeric therapeutic nanoparticles:design,development and clinical translation[J].Chem Soc Rev,2012,41(7):2971-3010.

6 Peer D,Karp JM,Hong S,et al.Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy[J].Nat Nanotechnol,2007,2(12):751-760.

7 Jain RK,Stylianopoulos T.Delivering nanomedicine to solid tumors[J].Nat Rev Clin Oncol,2010,7(11):653-664.

8 Bae Y,Kataoka K.Intelligent polymeric micelles from functional poly(ethylene glycol)-poly(amino acid)block copolymers[J].Adv Drug Deliv Rev,2009,61(10):768-784.

9 Lee ES,Gao Z,Bae YH.Recent progress in tumor pH targeting nanotechnology[J].J Control Release,2008,132(3):164-170.

10 Cardone RA,Casavola V,Reshkin SJ.The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+exchanger in metastasis[J].Nat Rev Cancer,2005,5(10):786-795.

11 Gao W,Chan JM,Farokhzad OC.pH-Responsive nanoparticles for drug delivery[J].Mol Pharm,2010,7(6):1913-1920.

12 Lee ES,Gao Z,Bae YH.Recent progress in tumor pH targeting nanotechnology[J].J Control Release,2008,132(3):164-170.

13 Ko J,Park K,Kim YS,et al.Tumoral acidic extracellular pH targeting of pH-responsive MPEG-poly(beta-amino ester)block copolymer micelles for cancer therapy[J].J Control Release,2007,123(2):109-115.

14 Lee ES,Na K,Bae YH.Polymeric micelle for tumor pH and folate-mediated targeting[J].J Control Release,2003,91:103-113.

15 Lee ES,Shin HJ,Na K,et al.Poly(L-histidine)-PEG block copolymer micelles and pH-induced destabilization[J].J Control Release 2003,90(3):363-374.

16 Kim D,Gao ZG,Lee ES,et al.In vivo evaluation of doxorubicin-loaded polymeric micelles targeting folate receptors and early endosomal pH in drug-resistant ovarian cancer[J].Mol Pharmaceut,2009,6(5):1353-1362.

17 Sethuraman VA,Bae YH.TAT peptide-based micelle system for potential active targeting of anti-cancer agents to acidic solid tumors[J].J Control Release,2007,118(2):216-224.

18 Arvizo RR,Miranda OR,Thompson MA,et al.Effect of nanoparticle surface charge at the plasma membrane and beyond[J].Nano Lett,2010,10(7):2543-2548.

19 Oupicky D,Ogris M,Howard KA,et al.Importance of lateral and steric stabilization of polyelectrolyte gene delivery vectors for extended systemic circulation[J].Mol Ther,2002,5(4):463-472.

20 Gratton SE,Ropp PA,Pohlhaus PD,et al.The effect of particle design on cellular internalization pathways[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(33):11613-11618.

21 Du JZ,Sun TM,Song WJ,et al.A tumor-acidity-activated charge-conversional nanogel as an intelligent vehicle for promoted tumoral-cell uptake and drug delivery[J].Angew Chem Int Eol Engl,2010,49(21):3621-3626.

22 Al-Hajj M.Cancer stem cells and oncology therapeutics[J].Curr Opin Genet Dev Oncol,2007,19(1):61-64.

23 Visvader JE,Lindeman GJ.Cancer stem cells in solid tumours:accumulating evidence and unresolved questions[J].Nat Rev Cancer 2008,8(10):755-768.

24 Borst P,Evers R,Kool M,et al.A family of drug transporters:the multidrug resistance-associated proteins[J].J Natl Cancer I,2000,92(16):1295-1302.

25 Al-Hajj M,Becker MW,Wicha M,et al.Therapeutic implications of cancer stem cells[J].Curr Opin Genet Dev,2004,14(1):43-47.

26 Du JZ,Du XJ,Mao CQ,et al.Tailor-made dual pH-sensitive polymer-doxorubicin nanoparticles for efficient anticancer drug delivery[J].J Am Chem Soc,2011,133(44):17560-17563.

27 Yuan YY,Mao CQ,Du XJ,et al.Surface charge switchable nanoparticles based on zwitterionic polymer for enhanced drug delivery to tumor[J].Adv Mater,2012,24(40):5476-5480.

28 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

29 Song EW,Lee SK,Wang J,et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J].Nat Med,2003,9(3):347-351.30 Akinc A,Zumbuehl A,Goldberg M,et al.A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics[J].Nat Biotechnol,2008,26(5):561-569.

31 Yang XZ,Du JZ,Dou S,et al.Sheddable ternary nanoparticles for tumor acidity-targeted siRNA delivery[J].ACS Nano,2012,6(1):771-781.