基因沉默抑制子HC-Pro表達載體的構建

金太成，許亞男，鄭 爽，張曉華，馮茹茹，劉秋霞，李雙雙，楊麗萍

(吉林師范大學 生命科學學院，吉林 四平 136000)

基因沉默抑制子HC-Pro表達載體的構建

金太成，許亞男，鄭 爽，張曉華，馮茹茹，劉秋霞，李雙雙，楊麗萍

(吉林師范大學 生命科學學院，吉林 四平 136000)

RNA沉默廣泛存在于植物等大多數真核生物中，能夠防御外源基因的入侵和調控基因表達等．然而，基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具體功能的研究并不十分清楚．本文重點介紹了基因沉默抑制子HC-Pro的表達載體pBI121-HC-Pro的構建及HC-Pro基因在煙草(Nicotianabenthamiana) 中的穩(wěn)定表達．并利用半定量RT-PCR技術檢測了目的基因HC-Pro的表達，檢測結果表明我們獲得了HC-Pro基因穩(wěn)定表達的轉基因煙草株系，為進一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了實驗基礎．

基因沉默抑制子；蚜傳輔助因子；穩(wěn)定表達；煙草

0 引言

RNA沉默廣泛存在于植物等大多數真核生物中，能夠影響或完全阻斷基因的表達，同時也參與調控轉座子、抗病毒反應、環(huán)境脅迫反應以及植物的生長發(fā)育等諸多過程，具有廣泛而重要的生物學意義．RNA沉默在植物界被稱為共抑制 (cosuppression)[1]、真菌中被稱為抑制(quelling)[2]、動物中稱為RNA干擾(RNA interference)[3-4]．

植物基因沉默被認為是保持自身基因組穩(wěn)定性，防御外來DNA序列包括防御病毒的一種保護機制．而病毒通過長期的進化，依賴自身編碼的基因沉默抑制蛋白來對抗宿主的RNA沉默．迄今為止，發(fā)現的基因沉默抑制子有30多種，最早被鑒定出來的是由煙草蝕紋病毒(TEV)編碼的HC-Pro和由黃瓜花葉病毒(CMV)編碼的2b蛋白[5]．這些沉默抑制子的結構和功能各異，能作用于RNA沉默的各個階段，對RNA沉默途徑的抑制也是多種多樣．其中，2b蛋白通過與AGO1互作并抑制其對靶標的剪切[6]，由馬鈴薯X病毒(PVX)編碼的p25通過干擾dsRNA的合成而抑制RNA沉默[7]，番茄叢矮病毒(TBSV)編碼的p19能夠結合siRNA雙鏈來阻止siRNA進入AGO蛋白[8]．而關于TEV病毒編碼的Hc-Pro的功能的研究結果并不一致．有的研究人員認為Hc-Pro部分影響轉入基因的DNA甲基化[9]，也有研究表明Hc-Pro作用后，轉入基因的插入位點仍舊保持DNA甲基化[10]．還有研究表明，由煙草蝕紋病毒(TEV)和馬鈴薯 Y 病毒(PVY)編碼的Hc-Pro蛋白能通過阻止21-24nt siRNA的形成或干擾siRNA的穩(wěn)定性在抵抗宿主的沉默效應中起作用[11]．總之，人們對Hc-Pro影響或調控基因沉默的機制并不十分清楚．

因此，我們對基因Hc-Pro的克隆，表達載體的構建，及沉默抑制子Hc-Pro蛋白的功能研究具有一定的研究意義．本研究利用PCR技術克隆了目的基因Hc-Pro，構建了HC-Pro表達載體pBI121-HcPro，并穩(wěn)定轉化了煙草(Nicotianabenthamiana)植株，半定量RT-PCR檢測結果表明我們獲得了四個HC-Pro轉基因煙草株系，為進一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能及其在與宿主RNA沉默機制中的作用奠定了實驗基礎．

1 材料和方法

1.1 表達載體p35S-pBI121

攜帶基因Hc-Pro的質粒由山東農大李向東教授惠贈，基因表達載體pBI121由周曉馥教授惠贈(見圖1)．

CaMV 35S promoter：為花椰菜花葉病毒35S啟動子；NOS-ter：為終止子；LB和RB：為T-DNA區(qū)的左右邊界；XbaI、BamHI等為多克隆位點．

圖1基因表達載體pBI121圖譜

1.2 植物材料

煙草(Nicotianabenthamiana)由東北師范大學王興智教授惠贈．將煙草種子用濃度為30%的84消毒液進行滅菌處理后，播種于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩周后再將小苗移栽到花盆中．以開花的煙草作為遺傳轉化的植物材料備用．

1.3 植物表達載體的構建

根據質粒攜帶的基因Hc-Pro序列設計引物(引物F:ATGTCAGCGGCAGAGCAATTTT；引物R前加SacI酶切位點:CGAGCTCTTAGCCAACTCTATAATGCTTCATTTC)，以質粒為模板經PCR擴增出的Hc-Pro基因片段，引物由博仕生物公司合成．將擴增片段連接到pMD18-T載體上，轉化超級感受態(tài)細胞DH5a．提取質粒DNA,將PMD18-T-Hc-Pro和pBI121分別用SacI/XbaI進行雙酶切，鼎國公司購買的DNA回收試劑盒回收，將回收目的片段與pBI121載體以摩爾比3∶1的比例進行4℃連接，構建成植物表達載體pBI121-Hc-Pro．將重組質粒pBI121-Hc-Pro送交北京華大基因進行測序．

將質粒pBI121-Hc-Pro轉化農桿菌EHA105感受態(tài)細胞．首先將1 μg質粒加到該感受態(tài)細胞中，并將它們保存在冰中30 min，再放在42℃恒溫水浴鍋中熱激 42 S，再放在冰上冰浴2 min；然后加1 ml LB 培養(yǎng)基，在28℃下輕搖1 h．將培養(yǎng)物離心收集菌體，涂在含有卡那霉素(Kana+)和利福平(Rif+)的LB培養(yǎng)基平板上．在28℃條件下，培養(yǎng)2-3天，可在培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆，并保存菌種．

1.4 農桿菌介導的煙草轉化

取保存的菌種進行搖菌和擴搖來制備菌液重懸液MMA，測定OD600值(一般為0.8-1.0)，然后采用蘸花法(詳見分子克隆)將攜帶表達載體pBI121-Hc-Pro的菌液重懸液浸泡煙草花，轉化后避光過夜，正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)并收獲煙草種子，再進行Hc-Pro轉基因煙草的篩選和基因表達的檢測分析．

2 結果與分析

2.1 pMD18-T-Hc-Pro陽性克隆的PCR鑒定和酶切鑒定

分別隨機挑取白色克隆的單菌落，作為PCR反應的模板，進行PCR反應后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果(如圖2A)．為了進一步鑒定重組子，從有目的擴增產物的克隆進行培養(yǎng)以提取質粒，再用限制性內切酶SacI/XbaI進行雙酶切鑒定．酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓為150v，1-2 h)分離，用紫外凝膠成像儀(UVIPhotoMW,BTS-20.M,EEC)進行觀察和拍照(如圖2B)．

A:M為分子Marker DL2000;1為陽性對照；4為陰性對照；2,3,5,6,7為陽性克隆的PCR產物；B:M為分子Marker DL2000;3-6為陽性克隆的SacⅠ/XbaⅠ酶切．

圖2pMD18-T-Hc-Pro陽性克隆的PCR鑒定和酶切鑒定

2.2 表達載體 pBI121-Hc-Pro的構建及檢測分析

從轉化平板上挑取8個單菌落進行菌落PCR，其鑒定結果為：1、4、8號單菌落都為陽性克?。?提取8個單菌落的質粒， 進行SacⅠ/XbaⅠ酶切鑒定，結果1、4、8號為陽性克隆(如圖3)．酶切鑒定結果與PCR鑒定結果一致，將1、4、8號質粒送樣測序(北京華大基因測序公司)．

2.3 半定量RT-PCR法檢測HC-Pro轉基因煙草

將攜帶表達載體pBI121-Hc-Pro穩(wěn)定轉化的煙草Nb種子播種在MS培養(yǎng)基，兩周后再將小苗移栽到花盆中，在正常溫度(25℃)和光照培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)．利用Trizal法提取煙草葉片的總RNA，并進行RT-PCR檢測分析，Actin為內參(如圖4)．

M為分子Marker DL 2000; 1,4,8為陽性克隆的酶切產物圖3 pBI121-Hc-Pro陽性克隆的酶切鑒定

圖4 轉基因煙草植株的半定量RT-PCR檢測結果

3 討論

植物基因沉默抑制子HC-Pro的功能是最早被發(fā)現的，人們對其沉默抑制機制的研究表明， HC-Pro蛋白是在轉錄后基因沉默中起作用，但是其在轉錄水平基因沉默機制中的作用與功能并不十分清楚．有的研究人員認為Hc-Pro部分影響轉入基因的DNA甲基化[4],也有研究表明Hc-Pro作用后的轉入基因的插入位點仍舊保持DNA甲基化[5]．因此，我們對HC-Pro功能的深入研究一方面有利于我們更清楚的理解HC-Pro與宿主互作的機制；另一方面，植物基因沉默抑制子還能被應用于植物生物反應器的研究．植物病毒能在宿主內通過阻斷潛在的防御反應來增強病毒的傳播能力和致病能力，因此，人們通過基因沉默抑制子的轉基因植株來提高外源蛋白的表達水平[11-16]．近年來，人們對植物病毒與宿主的互作研究成為國內外新的研究熱點，這些研究成果不僅加深了我們對植物RNA沉默機制等科學問題的認識，也最終會被抗病毒育種所應用．

[1]C.Napoli，C.Lemieux，R.Jorgensen．Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous gene in trans[J].Plant Cell,1990,2(4):279～289.

[2]C.Cogoni，N.Romano，G.Macino．Suppression of gene expression by homologous transgenes[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1994,65 (3):205～209.

[3]S.Guo，K.J.Kemphues．Par-1，a gene required for establishing polarity in C．elegans embryos， encodes a putative ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell,1995,81 (4):611～620.

[4]A.Fire，S.Xu，M.K.Montgomery，et al．Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]．Nature，1998，391 (6669)：806～811．

[5]G.Brigneti.Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana[J].Embo J,1998,17(22):6739～46.

[6]X.Zhang,Y.Yuan,Y.Pei,et al.Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1 cleavage activity to counter plant defense[J].Genes & Dev.2006,20:3255～3268.

[7]A.Hamilton,O.Voinnet,L.Cheppell,et al.Two classes of short interfering RNA in RNA silencing[J].Embo J,2002,21(17):4671～4679.

[8]P.Ounoyer,C.H.Leceuier,E.A.Parizotto,et al.Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNAsilencing[J].Plant Cell,2004,16(5):1235～1250.

[9]C.Llave,K.D.Kasschau,J.C.Carrington J C,et al．Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97 (24):13401～13406.

[10]A.C.Mallory,L.Ely,T.H.Smith,et al.HC-Pro suppression of transgene silencing eliminates the small RNAs but not transgene methylation or the mobile signal[J].Plant Cell,2001,13(3):571～583.

[11]蔣 琳,魏春紅,李 毅.病毒基因沉默抑制子及其作用機制[J]．中國科學，2012,42(1)：16～28．

[12]G.Pruss,Ge,X,Shi,X.M,Carrington,J.C,Vance,V.B.Plant viral synergism:the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that transactivates replication of viruses[J].Plant Cell,1997,9:859～868.

[13]K.Ye，L.Malinina，D.J.Patel．Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing[J]．Nature，2003，426(6968)：874～878．

[14]G.Brigneti,O.Voinnet,W.X.Li,et al.Viral pathogenicity deter-minants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana ben-thamiana[J].EMBO J,1998,17:6739～6746.

[15]K.D.Kasschau.J.C.Carrington.A counterdefensive strategy of plant viruses:suppression of posttranscriptional gene silencing[J].Cell,1998,95:461～470.

EstablishmentofexpressionvectorofgenesilencingsuppressorHC-Pro

JINTai-cheng,XUYan-an,ZHENGShuang,ZHANGXiao-hua,FENGRu-ru,LIUQiu-xia,LIShuang-shuang,YANGLi-ping

(School of Life Science,Jilin Normal University,Siping 136000,China)

RNA silencing is a conserved pathway that results in blockage of gene expression in both the cytoplasm and nucleus of eukaryotic organisms and is involved in regulating gene expression.Action of the gene silencing suppressor HC-Pro protein encoded by TEV is not clear.In this paper,we focuse on establishment of expression vector pBI121-HC-Proof gene silencing suppressor HC-Pro and stable expression of HC-Pro gene inNicotianabenthamianaplants.The expression of HC-Pro gene inNicotianabenthamianaplants was detested by semi-quantitative RT-PCR.The results showed that transgenetic tabacco lines of HC-Pro gene were acquired，and provided study base for action of the gene silencing suppressor HC-Pro protein.

gene silencing suppressor;HC-Pro;stable expression;Nicotianabenthamiana

林險峰)

2014-05-20

國家青年科學基金項目(31301043)；吉林省科技發(fā)展計劃青年科研基金項目 (20130522182JH)

金太成(1978-)，朝鮮族，男，吉林省輝南市人，現為吉林師范大學生命科學學院講師，博士.研究方向：植物生物反應器和植物抗逆生理．

Q94

A

1674-3873-(2014)03-0135-03