一種新型長效重組絨毛膜促性腺激素的表達(dá)、活性和藥代動力學(xué)研究

黃 虎, 楊 凡, 吳茂柏, 張玉杰, 鐘 翎,3, 侯永敏,

(1. 中山大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510006; 2. 廣州優(yōu)聯(lián)康醫(yī)藥科技有限公司, 廣州 510006;3. 深圳市藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心, 深圳 518024)

一種新型長效重組絨毛膜促性腺激素的表達(dá)、活性和藥代動力學(xué)研究

黃 虎1, 楊 凡1, 吳茂柏2, 張玉杰2, 鐘 翎1,3, 侯永敏1,2

(1. 中山大學(xué)藥學(xué)院,廣州 510006; 2. 廣州優(yōu)聯(lián)康醫(yī)藥科技有限公司, 廣州 510006;3. 深圳市藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心, 深圳 518024)

目的 構(gòu)建含有Fc片段的絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)新型長效重組hCG-Fc融合蛋白，可顯著延長其在血液中的半衰期，有利于提高患者用藥依從性。方法 首次將Fc DNA片段有序連接到hCG基因3′端，構(gòu)建hCG-Fc表達(dá)載體并將其穩(wěn)定表達(dá)在哺乳動物細(xì)胞，通過無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和基于親和層析的蛋白純化，制備了新型重組hCG-Fc融合蛋白。檢測其分子量、ELISA免疫活性和體內(nèi)生物活性，并測定其在大鼠體內(nèi)血循環(huán)半衰期。結(jié)果 重組融合蛋白分子量與理論推斷值相當(dāng)，ELISA活性為2 965 IU/mg，體內(nèi)生物活性為2 288 IU/mg，消除半衰期為174 h。結(jié)論 hCG-Fc融合蛋白構(gòu)建表達(dá)成功，且具有顯著的體內(nèi)外活性，藥代動力學(xué)分析顯示hCG-Fc重組融合蛋白半衰期是重組hCG的近6倍。這種新型長效融合蛋白在臨床上可大大減少注射次數(shù)，提高患者用藥依從性，具有顯著的社會和經(jīng)濟(jì)效益。

重組絨毛膜促性腺激素(γhCG); Fc融合蛋白; 長效; 藥代動力學(xué)

絨毛膜促性腺激素（hCG)是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌。其結(jié)構(gòu)為異源二聚體，α亞基與LH、FSH和TSH的α亞基相同，β亞基則是其特有的[1～2]。它是一種重要的生殖激素，對于有排卵障礙接受輔助生殖技術(shù)(ART)如胚胎移植的女性，可以促使卵泡最后成熟并誘發(fā)排卵[3]。其作用機(jī)制是：在懷孕早期，hCG與LH/hCG受體結(jié)合通過cAMP-磷脂酶C/三磷酸肌醇途徑介導(dǎo)的信號通路刺激黃體分泌孕酮，孕酮使子宮形成一根粗血管和微血管(即臍帶)以便供養(yǎng)生長中的胎兒[4]。

目前上市的hCG包括尿源hCG和重組hCG，尿源產(chǎn)品具有來源有限、潛在的病毒污染等缺陷，不被歐美等發(fā)達(dá)國家接受，重組蛋白可克服尿源蛋白產(chǎn)品的上述缺陷，已成為新藥開發(fā)的重要趨勢。重組hCG(Recombinant hCG)于2000年首次在美國上市，是通過哺乳動物細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)品。但其在人體內(nèi)的血漿半衰期僅為29 h，當(dāng)用于治療無排卵性不育癥時，患者必須每日1次肌肉注射hCG，通常需要連續(xù)注射5 d，這樣導(dǎo)致患者的治療成本較高同時患者的依從性較差[5]。因此，如何延長hCG在人體內(nèi)的血漿半衰期，制備長效重組hCG是一個很有價(jià)值的課題。

IgG類免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的血漿半衰期高達(dá)21 d，而Fc片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因，同時具有穩(wěn)定蛋白的作用[6]。

本研究將Fc片段有序連接到hCG羧基端，形成新型hCG-Fc融合蛋白，利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建hCG-Fc表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary cell, 簡稱CHO)中并實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)定表達(dá)，通過無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白純化獲得該融合蛋白。動物試驗(yàn)測定結(jié)果表明, 本研究中HCG-Fc融合蛋白具有顯著的體內(nèi)生物活性，藥物代謝動力學(xué)測定其半衰期是重組hCG的近6倍。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 3周齡雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量40～45 g; 8周齡雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200～210 g, 均購自廣東省廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵) 2011-0029]，在廣東省廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF設(shè)施[SYXK(粵)2011-0112]飼養(yǎng), 并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及儀器 各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購自TaKaRa公司; LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司; 預(yù)染蛋白marker購自Thermo公司; 福林酚試劑購自北京普博欣公司; 兔抗人hCGαβ多抗(ab54410)購自Abcam公司; HRP標(biāo)記的抗兔二抗購自ROCKLAND公司; HRP AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)(E030170-02)購自EarthOx公司; Protein A購自GE Health公司; HCG ELISA試劑盒(BC-1027)購自BioCheck公司; 《絨毛膜促性腺激素》標(biāo)準(zhǔn)品(批號為150513-200409，規(guī)格為60 IU/支)購自國家標(biāo)準(zhǔn)品網(wǎng)。

Bio-Rad蛋白純化系統(tǒng)；Bio-Rad電泳系統(tǒng);Tanon 1220型全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)。

1.1.3 載體和細(xì)胞 質(zhì)粒pUC57和真核表達(dá)載體pCBAEA3為Invitrogen公司產(chǎn)品; CHO細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 融合基因hCG-Fc和表達(dá)載體的構(gòu)建 編碼單鏈HCG前導(dǎo)肽和成熟蛋白的基因序列,以及編碼柔性肽接頭和人IgG Fc區(qū)域Fc的基因序列均是人工優(yōu)化過的CHO細(xì)胞偏愛密碼子，經(jīng)化學(xué)合成辦法獲得(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。限制性酶切各合成的基因片段和中間質(zhì)粒載體后，T4 DNA連接酶連接構(gòu)建成中間質(zhì)粒。從中間質(zhì)粒中酶切出L-Fc片段和hCG全長片段，T4 DNA連接酶連接至真核載體pCBAEA3的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)成表達(dá)載體pCBAEA3-hCG-Fc。

1.2.2 穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建與表達(dá)載體的鑒定 將表達(dá)載體pCBAEA3-HCG-Fc轉(zhuǎn)染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細(xì)胞(CHO朌HFR-), 采用電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 使用960 μFd電容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)，將其電場設(shè)置為250 V，在比色杯內(nèi)的2×107～5×107個細(xì)胞中加入10 μg用PvuI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染2 d后，將培養(yǎng)基改成含100 μg/ml Zeocin的生長培養(yǎng)基，并通過遞增濃度的MTX進(jìn)行加壓篩選(最高10 μmol/ml)獲得穩(wěn)定的hCG-Fc細(xì)胞株。提取質(zhì)粒并進(jìn)行NheI/EcoRI雙酶切鑒定表達(dá)載體，并采用ELISA法檢測hCG-Fc的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和hCG-Fc融合蛋白純化 將表達(dá)hCG-Fc的CHO細(xì)胞接入搖瓶，用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基逐步擴(kuò)增，每日稀釋至密度0.5×106/ml，當(dāng)體積達(dá)到500 ml時, 開始加入濃縮培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 d后，細(xì)胞離心取上清純化。

將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液上清, 上樣至磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Protein A柱, 用PBS洗滌該柱, 直至OD280值低于0.01, 再用20 mmol/L、pH為4.0的醋酸鈉緩沖液洗脫結(jié)合的重組hCG-Fc融合蛋白, 最后用pH10.0的1 mol/L Tris-HCl緩沖液中和活性收集液。洗脫所得樣品經(jīng)超濾將緩沖液換成20 mmol/L PB,pH7.0, 4 ℃保存, 0.22 μm濾膜過濾后分裝, -80℃保存。

1.2.4 蛋白分析鑒定 Lowry法測定純化所得融合蛋白濃度。SDS-PAGE法檢測Protein A純化結(jié)果、所得融合蛋白的純度和表觀分子量。分離膠濃度為8%，點(diǎn)樣10 μg。Western Blotting鑒定免疫特性。

1.2.5 ELISA活性和體內(nèi)活性測定 hCG ELISA試劑盒(BC-1027)檢測所得hCG-Fc融合蛋白的體外ELISA活性。參考Chorionic Gonadotrophin Assay(EP 7.0)[7]方法檢測體內(nèi)生物活性。3周齡雄性SPF級SD大鼠隨機(jī)分成標(biāo)準(zhǔn)品組、供試品組和空白組，其中標(biāo)準(zhǔn)品組和供試品組分別設(shè)置3個劑量組，總劑量分別為1 IU、2 IU、4 IU, 每組6只。

對各組實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行頸部皮下注射相應(yīng)的劑量藥品，每日同一時間注射一次，每次0.5 ml，連續(xù)注射4 d。于最后一次注射后24 h，將動物引頸處死，解剖后取其精囊腺，除去精囊腺周圍的脂肪組織等雜物，在濾紙上輕輕吸干表面的水分后在天平上精確稱量，記錄精囊腺重量。供試品效價(jià)測定結(jié)果按《中國藥典2010版 附錄XIV生物檢定統(tǒng)計(jì)法》量反應(yīng)平行線測定法，進(jìn)行可靠性測驗(yàn)?？煽啃詼y驗(yàn)通過后，計(jì)算效價(jià)和平均可信限率，并計(jì)算比活。

1.2.6 大鼠體內(nèi)半衰期測定和初步藥代動力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)動物分組: 將8周齡雄性SPF級SD大鼠分為hCG-Fc樣品組和空白組, 各組動物數(shù)量分別為3只和1只。給藥劑量: hCG-Fc樣品組依據(jù)前面ELISA方法測試出的活性確定給藥劑量為1 000 IU/kg，樣品緩沖液為滅菌生理鹽水; 空白組注射相同體積的生理鹽水。給藥方式: 頸部皮下注射, 0.5 ml/100g 體質(zhì)量。血樣采集及處理: hCG-Fc樣品組和空白組分別在給藥后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、144 h、264 h、312 h、384 h、432 h、552 h 采血。每次采血0.3 ml, 室溫下靜置30 min, 3 000 r/min常溫離心10 min，吸取上清液于另一滅菌EP管中，-80 ℃保存待測。血樣檢測及數(shù)據(jù)處理: 采用ELISA法(同1.2.5)測定各時間點(diǎn)血液中hCG免疫活性，并使用藥代動力學(xué)計(jì)算軟件PKSolver[8]計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 融合基因hCG-Fc結(jié)構(gòu)和真核表達(dá)載體中hCG-Fc基因序列驗(yàn)證

hCG-Fc全長基因由編碼含有前導(dǎo)肽的人hCGβ亞基, 不含前導(dǎo)肽的人hCGα亞基的核苷酸序列，柔性肽接頭核苷酸序列和人IgG2恒定區(qū)變體Fc的核苷酸序列融合而成。該融合蛋白的基因序列從5′到3′依次是編碼含前導(dǎo)肽的人hCGβ亞基，編碼不含前導(dǎo)肽的人hCGα亞基，編碼肽接頭序列L和編碼人IgG2恒定區(qū)Fc(圖1)。

圖 1 hCG-Fc融合蛋白的基因序列Figure 1 Gene sequence of hCG-Fc fusion protein

對篩選得到的重組子pCBAEA3-HCG-Fc進(jìn)行NheI/EcoRI雙酶切鑒定，得到1 491bp的產(chǎn)物，大小與預(yù)期的相符(圖2)。經(jīng)測序驗(yàn)證hCG-Fc基因序列正確。

2.2 hCG-Fc 融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

hCG-Fc在CHO細(xì)胞中的表達(dá)和生長狀況如圖3,在基礎(chǔ)無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增8 d后加入濃縮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度最高可達(dá)1.5×107個/ml，培養(yǎng)20 d，細(xì)胞表達(dá)量為1.25 g/L。

2.3 hCG-Fc融合蛋白分析鑒定

Lowry法檢測出hCG-Fc樣品的蛋白濃度為2.64 mg/ml。

圖 2 重組質(zhì)粒pCBAEA3-hCG-Fc的限制性酶切分析Figure 2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pCBAEA3-hCG-Fc

圖 3 表達(dá)hCG-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞生長曲線圖Figure 3 Growth curve of CHO cells expressed hCG-Fc fusion protein

圖 4 hCGαβ多抗(a)和Fc單抗(b)免疫鑒定hCG-Fc融合蛋白Figure 4 Identification of hCG-Fc protein by Western blotting with anti-hCGαβ polyclonal antibody (a) and anti-Fc monoclonal antibody (b)

圖5 hCG-Fc融合蛋白的SDS-PAGE純度和分子量分析Figure 5 Analysis of purity and molecular weight of hCG-Fc protein by SDS-PAGE

選用人尿來源hCG(uhCG)為對照，采用兔抗人hCG徠多抗和HRP AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)對純化后的HCG-Fc樣品進(jìn)行Western Blotting分析，結(jié)果如圖4, uhCG和hCG-Fc樣品分別在50 000和74 000顯示免疫雜交帶，與理論推導(dǎo)值一致，驗(yàn)證表達(dá)的蛋白為hCG-Fc融合蛋白。SDS-PAGE進(jìn)一步分析(圖5)表明hCG-Fc融合蛋白分子量為74 000，對照uhCG分子量為50 000。

2.4 體內(nèi)外活性分析

ELISA測得hCG-Fc融合蛋白的體外活性為7 827 IU/ml。數(shù)據(jù)結(jié)果如圖6，首先做出標(biāo)準(zhǔn)曲線-二次回歸曲線，然后將樣品的OD450值帶回回歸曲線求出活性回歸值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得到體外活性。結(jié)合Lowry法測得的濃度采用公式:體外比活性(IU/mg)=實(shí)測體外活性(IU/ml)/蛋白樣品的濃度(mg/ml)可算出所得的hCG-Fc融合蛋白體外ELISA比活性為2 965 IU/mg。

根據(jù)體外活性預(yù)估hCG-Fc融合蛋白樣品的體內(nèi)活性為6 990 IU/ml, 精囊腺增重法測得的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組的三個劑量的各個劑量組的精囊腺濕重均有顯著性差異, 與空白對照組之間均有顯著性差異, 而它們的對應(yīng)劑量組之間(如標(biāo)準(zhǔn)組的低劑量組與樣品組的低劑量組之間等)無顯著性差異, 標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組的精囊腺重曲線見圖7。由此說明此次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可用作估計(jì)活性的準(zhǔn)確計(jì)算。其方差分析和活性計(jì)算結(jié)果如圖8, 方差分析結(jié)果顯示檢驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定，活性計(jì)算結(jié)果也符合要求, 因此所計(jì)算的體內(nèi)活性即是hCG-Fc融合蛋白樣品的準(zhǔn)確的體內(nèi)活性。結(jié)合Lowry法測得的濃度采用公式: 體內(nèi)比活性(IU/mg)=實(shí)測體內(nèi)活性(IU/ml)/蛋白樣品的濃度(mg/ml)可算出所得hCG-Fc融合蛋白體內(nèi)比活性為2 288 IU/mg。

圖 6 hCG-Fc融合蛋白的ELISA活性分析Figure 6 ELISA analysis of hCG-Fc fusion protein

2.5 大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)初步分析

對大鼠單次皮下注射hCG-Fc融合蛋白，進(jìn)行血藥濃度及藥代動力學(xué)分析。hCG-Fc融合蛋白組血藥濃度-時間曲線如圖9, 空白組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間血藥濃度和實(shí)驗(yàn)組大鼠在0 h處的血藥濃度均為0，表明該實(shí)驗(yàn)本底影響極小，可忽略不計(jì)。通過PKSolver對血藥濃度進(jìn)行計(jì)算，分析結(jié)果見表1，顯示hCG-Fc消除半衰期為174 h，為已報(bào)道重組hCG半衰期(29 h)[9]的6倍。

圖 7 hCG-Fc體內(nèi)活性測試各組精囊腺重曲線Figure 7 Seminal vesicle weight curve of hCG-Fc in vivo activty test

圖 8 hCG-Fc體內(nèi)活性的方差分析和結(jié)果估算Figure 8 Anova of in vivo activity of hCG-Fc

圖 9 大鼠皮下單次注射hCG-Fc的藥時曲線Figure 9 Concentration-Time curve of hCG-Fc protein by single-subcutaneous injection into rats

表 1 大鼠皮下單次注射hCG-Fc后的藥代動力學(xué)分析Table 1 Pharmacokinetic analysis of hCG-Fc by single-subcutaneous injection into rats

3 討論

絨毛膜促性腺激素已廣泛應(yīng)用于不孕不育的治療，目前臨床上應(yīng)用的hCG主要分為兩大類：尿來源hCG和重組hCG。無論是尿來源hCG還是重組hCG，病人在接收治療時需要頻繁注射。因此為了減少給藥次數(shù)和頻繁注射疼痛，提高患者依從性，有必要進(jìn)行蛋白質(zhì)藥物的長效化研究。

重組蛋白質(zhì)藥物的長效化研究正是生物制藥的一個重要領(lǐng)域[10]。已有研究表明IgG中Fc片段可延長其融合蛋白的半衰期，提高Fc融合蛋白的穩(wěn)定性。Israel等提出，血液中免疫球蛋白之所以能長時間存在，F(xiàn)cRn發(fā)揮了重要作用，F(xiàn)cRn能保護(hù)IgG不被組織細(xì)胞中的溶酶體降解[11]。大量研究表明Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期都有不同程度的延長，如 rhEPO-L-Fc[12]和 FIX-Fc[13]等。

本研究目的是制備一種新型的長效hCG產(chǎn)品，以克服現(xiàn)有hCG產(chǎn)品的缺陷。如能將IgG的Fc區(qū)域與hCG進(jìn)行有序的結(jié)合并形成有功效的融合蛋白，理論上該hCG-Fc融合蛋白便可在一定程度上延長半衰期。另一方面，F(xiàn)c片段也可能會不同程度影響目標(biāo)蛋白的生物活性甚至使目標(biāo)蛋白完全失去活性，作者的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，有的Fc融合蛋白完全沒有體內(nèi)外活性。因此, 如何形成有功效的Fc融合蛋白需要解決以下幾個關(guān)鍵問題: (1)hCG兩個亞基與Fc的有序融合: 我們和研究表明, hCG-Fc融合蛋白的氨基酸序列從N端到C端依次包含hCGβ亞基、hCGα亞基、肽接頭和人IgG2 Fc片段,通過合適的肽接頭進(jìn)行有序的連接，可使融合蛋白高級結(jié)構(gòu)具有正確的構(gòu)型; (2)人IgG Fc種類的選擇：我們希望Fc片段的插入不會影響hCG活性，在四種人IgG同種型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中，人IgG2與FcγRs幾乎不結(jié)合，其Fc區(qū)域介導(dǎo)不良效應(yīng)子功能最小化，因此Fc片段是無活性的，從而不影響目標(biāo)蛋白hCG活性; (3)Fc片段在目標(biāo)蛋白中的插入位置: 考慮到目前國內(nèi)外批準(zhǔn)的Fc融合蛋白生物藥均為Fc位于目標(biāo)蛋白的羧基端，本研究將Fc片段通過肽接頭連接到hCG羧基端; (4)重組目標(biāo)蛋白的表達(dá)系統(tǒng): 由于hCG為糖蛋白，糖基化對hCG的體內(nèi)活性是必需的，因此我們選擇哺乳動物CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白，眾所周知，CHO細(xì)胞是當(dāng)今表達(dá)生產(chǎn)生物藥最為FDA接受的表達(dá)系統(tǒng)。

本研究所得HCG-Fc融合蛋白的體外ELISA比活性和體內(nèi)比活性均較uhCG的低。其具體原因可能有以下幾點(diǎn): ①本研究中使用的體內(nèi)活性檢測方法是直接采用歐洲藥典中uhCG的檢測方法，給藥和取材的間隔時間僅為24 h，而根據(jù)本研究中藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，hCG-Fc融合蛋白的半衰期比文獻(xiàn)報(bào)道的hCG半衰期提高了5倍，因此，直接采用該方法進(jìn)行活性測定可能并不準(zhǔn)確，也許只檢測到其實(shí)際活性中的小部分。在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步開展體內(nèi)活性的方法學(xué)研究，以得到HCG-Fc融合蛋白盡量客觀的活性。②hCG-Fc融合蛋白的分子量約為uhCG的1.5倍，因此相同的蛋白量下hCG-Fc融合蛋白含有活性中心(即hCG)的摩爾數(shù)僅為uhCG的2/3，如果從相同摩爾數(shù)的角度來計(jì)算，hCG-Fc融合蛋白的比活性是高于uhCG的比活性的; ③細(xì)胞培養(yǎng)和純化工藝還有待進(jìn)一步完善，需要通過優(yōu)化表達(dá)細(xì)胞株和純化方法來提高其高活性成分的含量以提高效價(jià)。

綜上所述, 本研究首次在哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了有功能的新型重組hCG-Fc融合蛋白。該融合蛋白具有較高生物活性且大鼠體內(nèi)半衰期延長達(dá)到了174 h, 比文獻(xiàn)報(bào)道的uhCG半衰期29 h提高了5倍, hCG-Fc能長期地有效地在體內(nèi)發(fā)揮藥效, 達(dá)到長效藥物的目的。今后的研究方向主要包括按照生物藥申報(bào)程序進(jìn)行動物藥效藥理試驗(yàn)，完成臨床研究，推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化和上市步伐。這種新型長效融合蛋白在臨床上可大大減少注射次數(shù)和病人痛苦, 提高患者用藥依從性，具有顯著的社會和經(jīng)濟(jì)效益。

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Expression, Activity and Pharmacokinetic Study of A Novel Long-Acting Recombinant Human Chorionic Gonadotropin

HUANG Hu1, YANG Fan1, WU Mao-bo2, ZHANG Yu-jie2, ZHONG Ling1,3, HOU Yong-min1,2
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China;2. Unicomed Pharma Ltd. Guangzhou 510006, China;3. Shenzhen Drug Administration, Shenzhen 518024, China)

ObjectiveTo make a novel long-acting hCG-Fc fusion protein that could prolong hCG’s serum half-life and improve the patients’ compliance.MethodsThe expression vector was constructed by the gene engineering that contains the gene encoding hCG-Fc which Fc fragment was fused into the 3’ end of hCG gene. The expression vector was transfected into CHO cells and stable clones were selected to express hCG-Fc fusion protein specifically. The serum free culture medium of cells grown was collected for protein purification using affinity based chromatography. The analysis of purified protein was performed as follow: molecular weight by SDS-PAGE, protein identity by Western blotting,activity in vitro by ELISA, activity in vivo by seminal vesicle weight gain assay, and serum half-life by single-subcutaneous injection into rats.ResultsThe molecular weight of hCG-Fc fusion protein is similar to the theoretical size. The ELISA activity of hCG-Fc protein is 2 965 IU/mg and in vivo activity is 2 288 IU/mg. The serum half-life in rats is 174 h.ConclusionshCG-Fc fusion protein is active and functional based on its in vitro activity and in vivo activity. Pharmacokinetic study shows that its serum half-life is almost six times of the recombinant hCG’s. This novel long-acting fusion protein can significantly reduce the times of injection and improve the patients’ compliance of medicine, and also could have huge social and economic benefits.

Recombinant human chorionic gonadotropin (rhCG); Fc fusion protein; Long Acting;Pharmacokinetics

Q819 Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0113-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.007

2014-01-09

廣州市創(chuàng)業(yè)領(lǐng)軍人才創(chuàng)業(yè)啟動基金項(xiàng)目(LCY201305)

黃 虎, 男(1987-), 碩士研究生, 研究方向: 微生物與生化藥學(xué)。E-mail: edghu@sina.com

鐘 翎(1963-), 女, 教授, 博士, 研究方向: 生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

E-mail: lsszhl@mail.sysu.edu.cn

侯永敏(1965-), 男, 教授, 博士, 研究方向: 醫(yī)藥生化與分子生物學(xué)。E-mail:ray091609@163.com