小鼠諾瓦克病毒研究現(xiàn)狀

劉 芹, 魏曉鋒, 高 誠2,

(1. 復旦大學, 上海 200032; 2. 上海市計劃生育科學研究所, 上海 200032;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

小鼠諾瓦克病毒研究現(xiàn)狀

劉 芹1,2, 魏曉鋒3, 高 誠2,3

(1. 復旦大學, 上海 200032; 2. 上海市計劃生育科學研究所, 上海 200032;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

諾瓦克病毒(Norwalk virus, NV), 也稱為諾如病毒(norovirus, NV)，是引起人類非細菌性胃腸炎的主要病原體，此外，在牛、豬和小鼠也發(fā)現(xiàn)了諾瓦克病毒的存在。該病毒可分5個基因型(GI～V)，鼠諾瓦克病毒(Murine norovirus, MNV)屬于GV，是一種新發(fā)現(xiàn)的感染實驗小鼠的病毒，并且被認為是目前小鼠中最流行的一種病毒。MNV是諾瓦克病毒中在細胞內(nèi)有效復制的病毒，被作為研究諾瓦克病毒復制分子機制的模型，同時 MNV與人諾瓦克病毒(Human noroviruses,HuNV)有許多相似的分子生物學特點，也被認為是研究人諾瓦克病毒的理想病毒模型。

小鼠諾瓦克病毒(MNV); 生物學特點; 流行病學

2003年，Karst等[1]在信號轉(zhuǎn)導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT1)以及重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG/STAT1-/-)小鼠中，首次發(fā)現(xiàn)并分離到小鼠諾瓦克病毒(Murine Norovirus, MNV)，并將其命名為小鼠諾瓦克病毒-1(Murine Norovirus-1, MNV-1)，MNV-1可以導致RAG/STAT1-/-小鼠發(fā)生致死性感染, 病變主要有腦炎、腦膜炎、腦脈管炎、肝炎和肺炎，MNV-1在干擾素αβ和干擾素γ受體陰性(IFNαβγR-/-)的小鼠內(nèi)較野生型小鼠內(nèi)毒力更強。自從MNV-1發(fā)現(xiàn)以來, 全世界范圍SPF級小鼠內(nèi)又分離出至少29個全序列MNV株, 這些病毒株有87%以上的遺傳同一性, 組成一個單一的基因群[2]。

1 MNV的生物學特性

MNV與其他諾瓦克病毒及杯狀病毒有許多生物學和分子學的相似性，屬于杯狀病毒科，無包膜，是線性、正義、單鏈RNA病毒[3]?；蚪MRNA長約7.4 kb，3’端有一個多聚A尾結(jié)構(gòu)，5’端共價連接病毒蛋白VPg[4]。諾瓦克病毒RNA基因組由三個主要的開放閱讀框架(open reading frames,ORF)組成，ORF1編碼一個多聚蛋白，分為幾個非結(jié)構(gòu)蛋白; ORF2編碼病毒衣殼蛋白(VP1); ORF3編碼一個小的結(jié)構(gòu)蛋白(VP2)[5], 此外在MNV基因組，還發(fā)現(xiàn)了ORF4，在ORF2重疊區(qū)[6]。

MNV是第一個報道能在細胞復制的諾瓦克病毒, 它可以在原代巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)生長, 也可以在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞內(nèi)生長并產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)(cytopathic effects, CPE)[7]。MNV-1感染RAW264.7細胞18 h后出現(xiàn)CPE，3 d后出現(xiàn)100%的CPE[8]，細胞病變表現(xiàn)為細胞邊緣不整齊，部分核固縮，接觸抑制障礙，聚集生長，細胞死亡等[8～9]。

MNV屬于腸道病原體，隨糞便脫落，主要通過糞口途徑傳播，也可以通過呼吸道傳播[10]。通過檢測和淘汰(test-and-removal)方法在受污染的設(shè)施內(nèi)很難根除MNV[11]，有研究表明，經(jīng)口接種MNV的小鼠通過糞便可以持續(xù)向體外排毒，8周后仍可在糞便和組織中檢測到病毒核酸，有很強的持續(xù)感染性[12～13]?？诜臃N60 d后在小鼠卵巢和子宮內(nèi)未檢測到MNV, 說明胚胎移植方法可以有效地清除病毒, 可以通過剖宮產(chǎn)來嘗試凈化MNV的感染[14]。

不同MNV病毒株感染小鼠的表現(xiàn)有差異性, 既可以有清除動力學的差異，也可以引起不同的細胞病變效應(yīng)(CPE), 在野生型小鼠和STAT1-/-小鼠內(nèi),MNV-1較MNV-3毒性更強，重要的是，MNV-3感染STAT1-/-小鼠癥狀與人諾瓦克病毒感染健康成年人的癥狀更相似棗體重下降，胃腹脹，腹瀉，可持續(xù)3 d[2]。

細胞轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IFN受體對于體內(nèi)抗MNV-1感染非常關(guān)鍵[1]，并且體外生長的MNV-1可以被IFN徠R和STAT1抑制[7]。60%～90%的乙醇可以對MNV起到良好的消毒效果[15]，所以使用含酒精成分的洗手液等清潔產(chǎn)品可能有助于預防人諾瓦克病毒的感染。溫度高于60℃時，可以觀察到MNV和病毒樣顆粒發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，這些改變可以影響病毒毒力，經(jīng)60～70 ℃處理的MNV，其感染性明顯下降，80 ℃和100 ℃處理后，噬斑試驗無噬斑形成[16],表明高于60 ℃時MNV可以失活，有助于預防其感染，并且可以作為處理食物污染MNV的依據(jù)。

2 MNV的檢測方法

MNV的檢測方法包括血清學方法、分子學檢測法以及噬斑試驗。

2.1 血清學方法

血清學方法是實驗小鼠病毒檢測最常用的方法，其中ELISA方法經(jīng)濟、快速、靈敏度好，并且特異性強，所以應(yīng)用廣泛，所用樣本為血清，可以動態(tài)觀察病毒感染情況。

MNV感染的診斷主要通過血清學方法，吸附ELISA實驗中，通過連續(xù)稀釋MNV,可檢出MNV的最低病毒量約為100個感染性病毒顆粒[16]。Hsu等[12]建立了一種高通量的新型血清學檢測方法棗流式熒光微球檢測技術(shù)，檢測小鼠內(nèi)的MNV抗體,檢測發(fā)現(xiàn)小鼠飼養(yǎng)設(shè)施中自然感染MNV非常普遍，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，具有高通量、靈敏度高，特異性強的優(yōu)點，例如，每反應(yīng)孔中僅需0.2 μl血清樣本就可同時檢測100種分析物，此方法有利于樣本量較少的實驗檢測。

新感染或免疫缺陷小鼠因為不產(chǎn)生免疫球蛋白，所以這種情況下血清學方法使用受限，需要采用分子學方法。

2.2 分子檢測法

RT-PCR可以直接檢測多種樣本，如糞便、組織、器官等。分子檢測方法，包括RT-PCR和實時RT-PCR都非常靈敏，但是不能區(qū)分感染性和非感染性病毒顆粒[17]。RT-qPCR現(xiàn)在被廣泛作為病毒RNA定量的方法。許多MNV的RT-qPCR實驗已經(jīng)被改進，可以估計感染組織、細胞或者糞便樣本中的病毒載量[1,18～20]。

日本實驗動物中央研究所曾將實驗感染的SCID小鼠和ICR小鼠分別與未感染的同品系小鼠混養(yǎng), 收集同居0 d、2 d、4 d、7 d、14 d和21 d的糞便, 利用PCR擴增糞便中的病毒核酸，結(jié)果表明，同居2 d后，1/3 SCID小鼠和3/4 ICR小鼠檢出NV, 同居4～21 d，所有小鼠均檢出NV[21]。

Hsu等[12]通過灌胃法對10只小鼠接種MNV-1病毒液，收集0～7 d的小鼠糞便，利用RT-PCR方法檢測糞便中MNV-1病毒核酸，發(fā)現(xiàn)0 d時無陽性結(jié)果，1 d時10只小鼠全部為陽性，2～7 d呈依次遞減趨勢，7 d時僅兩只小鼠為陽性。接種后第5周將小鼠實施安死術(shù)后進行解剖，糞便樣本無陽性結(jié)果，腸系膜淋巴結(jié)、脾、空腸組織中分別有3只、1只、1只檢測到MNV-1，實驗中設(shè)置對照組未感染MNV-1，結(jié)果均為陰性。

2.3 噬斑試驗

利用MNV在細胞內(nèi)增殖特點，可以通過噬斑試驗來量化樣本中的感染顆粒，原理是MNV-1可以溶解細胞，在融合的單層細胞上形成噬斑。在普通噬斑試驗的基礎(chǔ)上改進的熒光灶試驗(Fluorescent focus assay，F(xiàn)FA)可以更加快速、準確的檢測病毒, 但是使用的試劑及設(shè)備要求更高, 例如抗體, 計數(shù)集落形成單位的顯微鏡等。噬斑試驗還可以純化分離MNV，但并不是每個MNV病毒株都會形成噬斑，所以并不適用于所有的MNV[22]。

每種檢測方法都有其優(yōu)勢和不足，可以根據(jù)樣本性質(zhì)，采集樣本數(shù)，樣本量的多少，以及不同病毒株的特性，選擇不同的檢測方法，提高檢出率及檢測效率。

3 MNV的流行病學情況

MNV被認為是目前已知實驗小鼠病毒中最流行的病毒，其在小鼠中的感染率是排在第二位的細小病毒的10倍[23]。

2005年，密蘇里大學的診斷實驗室從美國和加拿大的研究機構(gòu)送檢的實驗小鼠(n=12 639)血清樣本中，利用熒光微球免疫法MFI(Multiplexed fluorescent immunoassay)測得血清抗MNV-1抗體陽性率為22.1%[12]。德國柏林的一項研究，收集來自于兩個獨立研究設(shè)施的76只小鼠，包括28個小鼠品系，經(jīng)檢測，有18(64.3%)個品系的43只(56.58%)小鼠出現(xiàn)MNV陽性[24]。用血清學方法檢測MNV，在北美和歐洲的感染率分別為32.64%和24.03%，總感染率為32.37%(n=44 876)[25]。Kim等[26]對韓國5個動物實驗室的包括30個小鼠品系的115個小鼠樣本進行檢測, 約23%的檢測樣本呈MNV陽性, 這是亞洲第一篇關(guān)于MNV的報道。Goto等[14]利用MNV的RNA聚合酶基因序列進行PCR檢測，約25%的小鼠飼養(yǎng)設(shè)施中發(fā)現(xiàn)MNV感染，感染率為13.1%(n=245)，但是盲腸樣本中MNV陽性的小鼠，無一例出現(xiàn)臨床癥狀。

袁文等[27]于2010年對廣東省內(nèi)7個小鼠繁育設(shè)施進行了感染情況的調(diào)查, 其中4個設(shè)施小鼠未發(fā)生MNV感染，另外3個設(shè)施小鼠感染率很高, 206份小鼠盲腸內(nèi)容物樣本中有77 份為陽性，陽性率為37.38%, 且各品系小鼠之間的感染率無顯著差異，這是國內(nèi)首次有關(guān)實驗小鼠攜帶MNV的報道。

Ohsugi 等[28]利用血清學和分子方法檢測來自日本和美國的普通和SPF級基因修飾小鼠以及日本3個動物繁殖設(shè)施的商品化小鼠, 日本普通小鼠MNV抗體陽性率為67.3%，SPF級小鼠為39.1%，美國普通小鼠為62.5%，三個動物繁殖設(shè)施中有一個的商品化SPF C57BL/6小鼠陽性率為20%。

由以上數(shù)據(jù)可見，MNV在實驗小鼠的感染很普遍，陽性率可因檢測方法或不同地區(qū)而有差異，但總體陽性率較高。

4 MNV研究的意義

實驗動物質(zhì)量檢測是保證實驗動物質(zhì)量的重要條件，同時也與人們的健康和日常生活息息相關(guān)。通過開展MNV的相關(guān)研究并建立與之相對的檢測方法，了解其感染狀況，可以為實驗動物的質(zhì)量控制打下堅實基礎(chǔ)。同時建立的檢測方法可在實驗動物生產(chǎn)單位和使用單位中推廣應(yīng)用，為進一步補充完善實驗動物質(zhì)量控制體系提供技術(shù)支持，促進實驗動物事業(yè)的健康發(fā)展。

人諾瓦克病毒是導致急性胃腸炎爆發(fā)的重要病原體之一。在全球感染人的非細菌性胃腸炎疾病的病例中超過90%是由該病毒引起的。利用MNV能在細胞內(nèi)增殖的特性，建立HuNV研究模型，可以進一步了解HuNV的特點，為其檢測、預防、治療提供參考。

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Situation on Research of Murine Norovirus

LIU Qin1,2, WEI Xiao-feng3, GAO Cheng2,3
(1. Fudan University, Shanghai 200032, China;2. Shanghai Institute of Planned Parenthood esearch, Shanghai 200032, China;3. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Norwalk virus, also known as norovirus, is the major pathogen to cause human nonbacterial gastroenteritis, in addition, Norwalk virus is also found in cattle, pigs and mice . Norwalk virus can be divided into five genotypes (GI-V), and the murine norovirus (MNV) belongs to GV. MNV is a newly discovered virus infection in laboratory mice, and is considered to be the most popular form of mouse virus. Now, MNV is the only one that can be replicated efficiently in cells of the Norwalk virus, so MNV is regarded as a research model for the molecular mechanism of Norwalk virus. Moreover, MNV and human Norovirus (HuNV) have many similar characteristics of molecular biology, and also is considered to be the ideal virus model for study of human norovirus.

Murine norovirus(MNV); Biological characteristics; Epidemiology

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0167-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.019

2013-10-18

上海市科委創(chuàng)新行動計劃“小鼠諾瓦克病毒的特性研究”(NO.12140900502)

劉 芹(1987-), 女, 碩士, 研究方向: 實驗動物質(zhì)量控制。E-mail: liuqin870101@126.com

魏曉鋒, 男, 副研究員, 研究方向: 實驗動物質(zhì)量控制。E-mail: wei.xf@outlook.com